[發明專利]頭孢氨芐殘留酶聯免疫檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 200810222094.1
• 申請日: 2008-09-09
• 公開（公告）號: CN101354401A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 金涌;鄒明強;陳立本;王羚鴻;郝剛
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司
• 代理人: 解政文

技術領域

本發明涉及一種獸藥殘留的免疫化學速測技術，特別是涉及一種用于頭孢氨芐殘留檢測 的酶聯免疫檢測試劑盒及其應用。

背景技術

頭孢氨芐(Cephalexin)是β-內酰胺類抗生素。獸醫臨床廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療 動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當或不遵守休藥期規定等原因，均 可造成它在畜產品中的殘留，給人類健康帶來嚴重危害。針對該藥物在食品中的殘留，我國 農業部發布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定，牛奶中的最大殘留限量為100μg/kg， 肌肉、脂肪中的最大殘留限量為200μg/kg。

目前，用于檢測頭孢氨芐的方法主要有微生物法、色譜法或色譜-質譜聯用分析法、免疫 分析法等。微生物檢測法操作簡單，但其檢測周期長且結果誤差較大。色譜法或色譜-質譜聯 用技術雖然靈敏度高，但是樣品前處理及測定操作繁瑣、費用高，不適于大量樣品的快速檢 測。

免疫分析法(Immunoassay)具有極高的選擇性和靈敏度，是廣泛使用的快速篩查方法。 基于酶標記物放大作用的免疫分析稱為酶聯免疫吸附試驗法(Enzyme?Linked?Immunosorbent Assay，即ELISA)，ELISA以其具有靈敏、快速、特異、簡便等優點，廣泛應用于現場監控 和大規模樣品篩查。

發明內容

本發明的目的是提供一種操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現場監控且適合大量樣 本篩查，用于檢測牛奶及動物組織中頭孢氨芐藥物殘留量的酶聯免疫檢測試劑盒。

一種頭孢氨芐殘留酶聯免疫檢測試劑盒，其中設置有以下成分：

包被有包被原的酶標板，所述包被原為頭孢氨芐與載體蛋白的偶聯物；

頭孢氨芐特異性抗體；

酶標記物；

頭孢氨芐標準品溶液：0μg/L-5μg/L；

底物顯色液；

終止液；

濃縮洗滌液；和

樣品稀釋液。

本發明的試劑盒，其中所述酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成0.5-1μg/mL， 每孔加入100μL，37℃溫育2h，再4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次30秒， 拍干，然后在每孔中加入200μL封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜 真空密封保存。

本發明的試劑盒，其中所述酶標板在制備過程中所用的包被緩沖液為pH9.6，0.05mol/L的 碳酸鹽緩沖液；所用的封閉液是1％-5％牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。

本發明的試劑盒，其中所述頭孢氨芐特異性抗體為頭孢氨芐單克隆抗體，其是用頭孢氨芐與 載體蛋白采用碳化二亞胺法得到的偶聯物作為免疫原，利用雜交瘤技術得到的。其具體制備 過程為：

(1)動物免疫：采用雌性BALB/C純系小鼠作為免疫動物，以頭孢氨芐與載體蛋白牛血清白 蛋白偶聯物為免疫原；

(2)細胞融合與克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞融合，篩選細胞株， 得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

(3)單克隆抗體的制備與純化：使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑，5 天后腹腔注射雜交瘤細胞株10⁶個/只，7天后取小鼠腹水，進行純化后得單克隆抗體分裝， -20℃保存。

本發明的試劑盒，其中所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、甲 狀腺蛋白(BCG)、卵清蛋白(OVA)或血藍蛋白(KLH)等常用蛋白。

本發明的試劑盒，其中所述酶標記物為酶標記羊抗鼠抗抗體，其中酶標記物的標記酶為辣根 過氧化物，酶標記的羊抗鼠抗抗體是采用過碘酸鈉法將標記酶與羊抗鼠抗抗體進行偶聯得到 的。

本發明的試劑盒，其中所述底物顯色液由體積比為1：1的顯色液A液和顯色液B液組成， 顯色液A液為過氧化脲，顯色液B液為四甲基聯苯胺。

本發明的試劑盒，其中所述終止液為1-2mol/L的硫酸。所述濃縮洗滌液為pH7.4含0.5％-1％ 吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。所述樣品稀釋液為含有0.1％-1％牛血清白蛋白的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液。

本發明還提供一種利用所述的頭孢氨芐殘留酶聯免疫檢測試劑盒檢測頭孢氨芐殘留的方法， 包括以下步驟：