[發明專利]頭孢氨芐殘留酶聯免疫檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 200810222094.1
• 申請日: 2008-09-09
• 公開（公告）號: CN101354401A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 金涌;鄒明強;陳立本;王羚鴻;郝剛
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司
• 代理人: 解政文

1.一種頭孢氨芐殘留酶聯免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：

(1)蛋白偶聯抗原的合成：

A.頭孢氨芐免疫抗原的合成：將頭孢氨芐和牛血清白蛋白采用碳二亞胺法進行偶聯得到 免疫抗原；具體操作如下：取頭孢氨芐15mg溶于5mL?0.01mol/L，pH?7.4的PBS中，加入 25mg碳二亞胺和10mgN-羥基琥珀酰亞胺攪拌30分鐘，取牛血清白蛋白10mg溶于活化的 頭孢氨芐溶液中，25℃攪拌反應2小時，再4℃反應過夜；4℃條件下，用PBS透析3天，得 到頭孢氨芐免疫抗原，分裝凍存；

B.頭孢氨芐包被抗原的合成：將頭孢氨芐和卵清蛋白采用戊二醛法進行偶聯得到包被抗 原；具體操作如下：取頭孢氨芐10mg溶于5mL?0.01mol/L，pH?7.4的PBS中，加入1％戊二 醛溶液攪拌30分鐘，取卵清蛋白30mg溶于1mL?PBS，加入到活化的頭孢氨芐溶液中，25℃ 攪拌反應2小時，4℃反應過夜；4℃條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐包被抗原，分 裝凍存；

(2)單克隆抗體的制備：

A.動物免疫：將合成的免疫原與等量的弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射8周齡雌性BALB/C 小鼠，劑量為100μg/只；然后以100μg/只的劑量加弗氏不完全佐劑腹腔注射加強免疫3次， 間隔2周；

B.細胞融合和克隆化：取免疫小鼠的脾細胞，按5∶1比例與Sp2/0骨髓瘤細胞融合，制 備雜交瘤細胞；采用有限稀釋法篩選能夠穩定分泌頭孢氨芐單克隆抗體的雜交瘤細胞株，擴 大培養后液氮凍存；

C.單克隆抗體的制備與純化：使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑0.5 mL/只，5天后腹腔注射雜交瘤細胞10⁶個/只，7天后取小鼠腹水，經辛酸-飽和硫酸銨法進行純 化，分裝，-20℃保存；

(3)試劑盒的制備：

A.酶標板的制備：

用包被緩沖液將頭孢氨芐包被抗原稀釋成0.5-1μg/mL，每孔加入100μL，37℃溫育2h再 4℃過夜，傾去包被液，用稀釋20倍的濃縮洗滌液洗滌4次，每次30秒，拍干，然后在每孔 中加入200μL封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存；

B.所用試劑的配置：

1)頭孢氨芐系列濃度標準溶液，其濃度分別為0μg/L，0.05μg/L，0.1μg/L，0.5μg/L，1μg/L， 5μg/L；

2)蛋白濃度為0.1-1mg/L的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG；

3)蛋白濃度為0.1-1mg/L的頭孢氨芐單克隆抗體；

4)底物顯色液由A液和B液組成，A液為用0.1mol/L?pH5.0的檸檬酸緩沖液配制成0.1-1 mg/mL的過氧化脲溶液，B液為四甲基聯苯胺先用無水乙醇配制2mg/mL的溶液，再用0.1 mol/L?pH5.0的檸檬酸緩沖液配制成0.1-1mg/mL溶液；

5)終止液為1-2mol/L硫酸；

6)濃縮洗滌液為pH7.4含0.8-1.2％吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液；

7)樣品稀釋液為0.1％-1％牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。