[發(fā)明專利]分子設計的結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白β亞基類熒光蛋白及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810219672.6
• 申請日: 2008-12-04
• 公開（公告）號: CN101759794A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發(fā)明（設計）人: 夏坤;佟順剛
• 申請（專利權）人: 廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司
• 主分類號: C07K14/405
• 分類號: C07K14/405;C07K19/00;C12N15/31;C12N15/62;C12N15/63;G01N33/52;G01N33/543
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉媖

技術領域

本發(fā)明涉及一種分子設計的結合藻紅膽素的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白及其應用，屬于生物技術中色素蛋白質(zhì)材料領域，具體涉及結合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體，以及利用此融合蛋白檢測可溶性抗原或抗體的檢測方法。

背景技術

藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650～660nm的可見光，發(fā)射約660～670nm的熒光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB)；PEC的alpha亞基結合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB)；PEC的beta亞基結合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB)；CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。

可以從藻類中提取得到藻紅藍蛋白，并分離出其alpha和beta亞基，alpha亞基的80位半胱氨酸殘基通過硫醚健共價結合藻藍膽素PCB，beta亞基82位和153位半胱氨酸殘基分別通過硫醚健共價結合藻藍膽素PCB；也可以通過基因工程利用大腸桿菌進行生產(chǎn)。PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley?AJ，GlazerAN.Biosynthesis?ofthecyanobacterial?light-harvesting?polypeptide?phycoerythrocyanin?holo-alpha?subunit?in?aheterologous?host.J?Bacteriol.2002；184(17)：4666～4671)。PEC的beta亞基也可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)。我們發(fā)現(xiàn)，利用基因工程，不僅可以得到藻紅藍蛋白beta亞基153位結合藻藍膽素PCB的熒光蛋白(其光譜圖如圖1所示)，同時還可以對其肽鏈氨基酸進行突變、進行有益的標記，更重要的是，我們可以得到一種結合藻紅膽素PEB而不是結合藻藍膽素PCB的熒光藻紅藍蛋白beta亞基(如圖2、圖3所示)。這種結合了PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白，由于結合了新的色素PEB，其熒光特性與天然的結合PCB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白有明顯區(qū)別。

鏈霉親和素可以跟生物素特異結合，通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，可以實現(xiàn)信號放大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應用于生物學檢測和醫(yī)療檢測等領域。目前主要是通過化學交聯(lián)實現(xiàn)鏈霉親和素對目標的標記。本發(fā)明通過基因工程技術，把鏈霉親和素基因和藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達得到鏈霉親和素和藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實現(xiàn)鏈霉親和素和藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白的連接；通過藻膽蛋白beta裂合酶能催化藻紅膽素與藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質(zhì)共價結合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì)的鏈霉親和素標記的結合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)(其光譜如圖4、圖5所示)。此蛋白可直接應用于免疫熒光檢測等領域。

免疫熒光技術(Immunofluorescence?technique)又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種免疫熒光技術(Immunofluorescence?technique)又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進行標記而獲得成功。