[發明專利]腺病毒轉染的初級細胞以及路徑圖譜繪制方法

無效

• 申請號: 200810215331.1
• 申請日: 2004-12-01
• 公開（公告）號: CN101353706A
• 公開（公告）日: 2009-01-28
• 發明（設計）人: 韓昌洙;李黎
• 申請（專利權）人: 安萬特藥物公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/66;C12Q1/02;C12N15/861;C12N5/10
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所
• 代理人: 黃革生;林柏楠

本申請是申請日為2004年12月01日、發明創造名稱為“腺病毒轉染 的初級細胞以及路徑圖譜繪制方法”的中國專利申請200480034585.3 (PCT/US2004/040054)的分案申請。

發明背景

發明領域

本發明涉及路徑圖譜繪制領域，特別是非永生細胞系免疫細胞的路徑 圖譜繪制。本發明還涉及調控胞內信號傳遞路徑表達的領域。

相關領域的說明

胞內信號傳遞路徑是這樣的一組基因，其表達受到由初始刺激起始的 基因到基因的相互作用級聯的控制。換言之，胞內信號傳遞路徑的初始刺 激直接地或者通過路徑中的另一基因間接地控制該路徑中每一個基因的表 達。已知的信號傳遞路徑參與包括免疫應答、發育、有絲分裂和炎癥等在 內的廣泛的生物活動，而且包括但不限于：促分裂原活化蛋白激酶 (“MAPK”)路徑，蛋白激酶A(“PKA”)信號傳遞路徑，蛋白激酶C (“PKC”)信號傳遞路徑，I型干擾素信號傳遞路徑，鈣調磷酸酶(“CaN”) 信號傳遞路徑，κB細胞順式作用核因子(“NFκB”)信號傳遞路徑以及 IκB激酶(“IKK”)信號傳遞路徑。盡管在廣泛的疾病狀態中都牽涉到信 號傳遞路徑缺陷，但在許多情況下，我們對于初始刺激和最終的細胞應答 之間的信號傳遞路徑知之甚少。

路徑圖譜繪制通常是指闡明路徑初始刺激和最終應答之間的步驟。就 本發明來說，“路徑圖譜繪制”是指確定候選順式作用調節元件是否直接 或間接地受給定信號傳遞路徑的控制。已知的路徑圖譜繪制方法采用來自 培養的細胞系的宿主細胞，該宿主細胞已用含有有效地連接于待測調節元 件的報告基因的DNA質粒轉染。本領域已很好地確立了報告基因的使用。 參見Kain，SR和Ganguly，S，《最新分子生物學實驗方法匯編》中第9.6 單元的“基因報告系統綜述”(Overview?of?Genetic?Reporter?Systems，Unit 9.6?in?Current?Protocols?in?Molecular?Biology)，編輯Ausubel，FM等人 (Wiley?and?Sons，NY，1995)。

轉染是指將外來DNA導入宿主細胞如培養的哺乳動物細胞中。已證 明轉染是分析基因及其相關基因產物的功能、調節和相互作用的強有力工 具。本領域已經很好地確立了轉染細胞的操作。化學和物理轉染方法包括 DEAEdextran(Fox?RM等人，《生物化學》(Biochemistry)10月4日； 16(20)：4470-7，PMID?911769(1977))，磷酸鈣(Pear，W.S.，Nolan，G.P.， Scott，M.L.，&?Baltimore，D.《美國國家科學院院報》(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)90，8392(1993))，脂質體介導的轉染(Zhang?WW等人，《生物 技術》(Biotechniques)11月；15(5)：868-72(1993))，微注射 (Colbere-Garapin?F和Garapin?AC，《發育生物學標準》(Dev?Biol?Stand)； 55：267-71，PMID：6329857(1983))以及電穿孔(Neumann?E和Kakorin?S， 《癌癥研究和治療技術》(Technol?Cancer?Res?Treat.)10月； 1(5)：329-40(2002))。本領域也已很好地確立了重組腺病毒載體在轉染中的 用途。參見Berkner，KL和Sharp，PA《核酸研究》(Nucelic?Acids?Res.) 11：6003-6020(1983)；Berkner，KL和Sharp，PA《生物技術》 (BioTechniques)6：616-629(1988)；Bett，AJ，Haddara，W，Prevec，L和 Graham，FL《美國國家科學院院報》(PNAS)USA?91：8802-8806(1994)； Hitt，M，Addison，CL和Graham，FL《藥理學進展》(Adv.Pharmacol.) 40：137-206(1997)。其中，重組腺病毒業已被用來轉染心臟組織(Ardehali， A.J.Thor.Cardiovas.Surg.111：246-252(1996))和淋巴細胞(Leon，RP， Hedlund，T，Meech，SJ，Li，S，Schaack，J，Hunger，SP，Duke，RC和 DeGregori，J《美國國家科學院院報》(PNAS)USA?95：13159-13164 (1998))。人類腺病毒系雙鏈DNA病毒，其通過受體介導的內吞作用而進 入細胞。這些病毒由于易于培養和操作且顯示出廣泛的體內體外宿主范圍 而被認為非常適合用于基因轉移。腺病毒能夠感染靜止的以及復制中的靶 細胞，并持續存在于染色體之外，而不是整合到宿主染色體組中。重組腺 病毒能夠容納相對較大的外來DNA片段(大約7kb)，并具備高滴度病毒 產量的優點。