[發明專利]源于鏈霉菌屬的環氧化物水解酶

無效

• 申請號: 200810213640.5
• 申請日: 2000-07-26
• 公開（公告）號: CN101363015A
• 公開（公告）日: 2009-02-11
• 發明（設計）人: F·措赫爾;M·恩策爾貝格;R·D·施米德;W·沃萊本;B·豪爾
• 申請（專利權）人: BASF公司
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N1/20;C12P41/00;C12P7/02;C12Q1/34;C12Q1/04;C12R1/48
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 李連濤

本申請是國際申請日為2000年7月26日(國際申請號為PCT/EP00/07211)、進入國家階段申請號為00813375.1的題為“源于鏈霉菌屬的環氧化物水解酶”的發明專利申請的分案申請。

技術領域：

本發明涉及可從鏈霉菌屬的細菌中分離到的改進的環氧化物水解酶、一種環氧化物對映體混合物的新的酶促分離方法、環氧化物水解酶活性的新的檢測方法、檢測環氧化物水解酶活性的篩選方法和鏈霉菌屬的細菌及其產生的環氧化物水解酶用于進行對映選擇性環氧化物水解的用途。

背景技術：

尤其是在制藥和農用化學品工業中，對映純的化合物變得愈來愈重要，這就需要能夠可靠和經濟地獲得光學活性物質。已有幾種制備對映純的二醇和環氧化物的方法。

在環氧化物的不對稱性化學合成過程中，合成起始于前手性化合物。通過利用手性試劑，例如手性過酸，手性二環氧乙烷或Oxaziridins或手性硼酸酯(鹽)、手性輔劑或手性的、金屬的或非金屬的催化劑，能夠生成手性環氧化物。合成手性環氧化物的最著名途徑是在有過渡金屬催化劑存在的條件下，鏈烯醇(Alkenolen)，例如烯丙醇與氫過氧化物的Sharpless環氧化反應。

通過生物化學途徑制備對映純二醇的方法也是已知的。具有環氧化物水解酶活性的微生物催化環氧化物的區域專一性和對映專一性水解反應。它們裂解環氧化物中的乙醚鍵，從而形成二醇。能夠使寬范圍的外消旋環氧化物對映選擇性水解的幾種細菌菌株已有記載。然而，迄今為止已知的環氧化物水解酶的數量及其在有機合成中的應用仍非常有限。具有環氧化物水解酶活性的已知菌株是，例如黑曲霉LCP521，sulfurescens桿菌ATCC?7159，紅球菌NCIMB?11216等。

然而，具有環氧化物水解酶活性的已知菌株的底物范圍通常很有限并且反應速率通常很低。并且，使用這些菌株所獲得的對映選擇性通常過低[Grogan，G.等，FEMSMicrobiology?Lett.141(1996)，239-243；Kroutil，W.，等，四面體通訊(Tetrahedron?Lett.)(1996)，8379-8382]。所述已知菌株很難進行遺傳操作并且有些菌株很難進行培養。因此，迄今為止，在重組形式的大腸桿菌中只獲得了兩種環氧化物水解酶[棒狀桿菌C12，(Misawa，E.等，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)，253(1998)，173-183)和放射形土壤桿菌AD1(Rink，R.，等，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)，272(1997)，14650-14657)]。即便是由微生物得到環氧化物水解酶的純化到目前為止也只記載了紅球菌NCIMB?11216[Faber，K.等，生物技術通訊(Biotechno?logy?Lett.)17(1995)，893-898]和Norcardia?EH1[Kroutil，W.，等，生物技術雜志(J.Biotechnol.)61(1998)，143-150]這兩種情況。這兩種情況下的純化是相當復雜的。從棒狀桿菌C12富集環氧化物水解酶已在Misawa，E.等，歐洲生物化學雜志(Eur.J.Biochem.)，253(1998)，173-183中進行了描述。

另外，由于例如在一組微生物菌株中篩選(即系統實驗)產生新型環氧化物水解酶的微生物直到目前為止都需要花費大量的時間，所以很難尋找到含有新型環氧化物水解酶的微生物。這是由于，篩選使用的是常規方法，在這些方法中必須對單個的被篩選物進行處理并單個進行氣相色譜或液相色譜分析。

發明內容：

因此本發明的第一個目的是提供底物范圍拓寬了的和/或反應性增強了的和/或對映選擇性提高了的新型環氧化物水解酶。另外，尤其是新型環氧化物水解酶應能夠從容易培養的非致病生物體中分離到，而且，任選具有良好的分子生物學可接近性(Zugnglichkeit)。

本發明的第二個目的是提供一種更快捷、更簡單地檢測環氧化物水解酶的方法，該方法應還能改進篩選產生環氧化物水解酶的微生物的方法。

本發明的第三個目的是提供一種改進的分離環氧化物對映體混合物的生物化學方法以及一種改進的環氧化物對映選擇性反應的方法，該方法能夠通過簡單的途徑獲得對映純的二醇和/或環氧化物。

本發明的第四個目的是提供新的產生環氧化物水解酶的微生物。

我們驚奇地發現，通過提供源自鏈霉菌屬微生物的環氧化物水解酶(E.C.3.3.2.3)能夠達到上述的第一個目的。至今沒有關于該菌屬微生物環氧化物水解酶活性的記載。