[發(fā)明專利]制備可溶高活性重組人表皮生長因子的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200810211603.0 | 申請日： | 2008-09-22 |
| 公開（公告）號： | CN101353659A | 公開（公告）日： | 2009-01-28 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 楊霞 | 申請（專利權(quán)）人： | 楊霞 |
| 主分類號： | C12N15/12 | 分類號： | C12N15/12;C12N15/70;C07K14/485;C07K1/14 |
| 代理公司： | 山西太原科衛(wèi)專利事務(wù)所 | 代理人： | 朱源 |
| 地址： | 030001山西省太原*** | 國省代碼： | 山西;14 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 制備 可溶 活性 重組 表皮 生長因子 方法 | ||
1.一種制備可溶高活性重組人表皮生長因子的方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)根據(jù)人表皮生長因子hEGF全長序列設(shè)計引物，并替換掉大腸桿菌不利表達(dá)的密碼子以獲得優(yōu)化的基因序列nhEGF，該基因序列nhEGF如序列表SEQ?ID?NO：1所示的序列；在nhEGF基因序列的3`末端增加HIS標(biāo)簽序列HIS6，再將nhEGF基因序列加HIS標(biāo)簽序列的基因克隆進(jìn)入pET-21b載體；接著再將分子伴侶PDI的全長基因序列與nhEGF基因序列連接；然后在PDI基因序列的前端加入Prescission?Protease蛋白酶切位點序列pp，這樣即重組成表達(dá)載體pET-21b-nhEGF-HIS6-pp-PDI；相應(yīng)表達(dá)出的重組蛋白為hEGF-HIS6-pp-PDI；
(2)將步驟(1)中構(gòu)建好的表達(dá)載體pET-21b-nhEGF-HIS6-pp-PDI轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia?coli)Rosseta，用IPTG儲液誘導(dǎo)重組基因的表達(dá)，離心收集菌體；同時將含有Prescission?Protease的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株，同樣用IPTG儲液誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體；然后將兩種菌體混合在一起；
(3)用Tris緩沖液重懸得到的菌體，超聲破碎，離心收集上清液；調(diào)整PH值為7.0-8.0，低溫振蕩使Prescission?Protease將重組蛋白酶切完全，釋放出hEGF蛋白，得到含有人表皮生長因子的溶液；
(4)將含有人表皮生長因子的溶液進(jìn)行純化處理，得到含有人表皮生長因子的純化物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備可溶高活性重組人表皮生長因子的方法，其特征在于：步驟(4)中對含有人表皮生長因子的溶液進(jìn)行純化的具體步驟為，調(diào)整上述溶液的PH值為7.0-8.0，然后上鎳離子親和柱，用Tris緩沖溶液上柱，?50mM咪唑洗脫雜蛋白，300mM咪唑洗脫目的蛋白；透析過夜，即得到人表皮生長因子的純化物。?
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