[發明專利]一種構建酵母雙價通用表達載體的方法

無效

• 申請號: 200810209569.3
• 申請日: 2008-11-28
• 公開（公告）號: CN101407823A
• 公開（公告）日: 2009-04-15
• 發明（設計）人: 劉關君;劉桂豐;楊傳平;劉明坤;閻秀峰;許志茹;魏志剛;王柏臣
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 榮 玲

技術領域

本發明涉及一種構建雙價表達載體的方法。

背景技術

近些年來隨著生物技術迅速發展，通過基因工程對生物進行有目的的改造已經成為了可能，但所報道多是對單個基因操作轉化。然而自然界中生物許多性狀往往是由多個基因控制，一般生化代謝途徑需要多種酶催化作用才能完成，并且有時單個基因轉化常表現為超強表達或抑制沉默，同時轉入兩個或兩個以上起協同作用的基因對于轉基因是迫切需要的。將目的基因構建在同一個表達載體上，多基因表達載體構建完成后，只需要通過一次轉化就可方便地獲得多價基因同時表達的轉基因產物。現有構建雙價載體的方法都是構建固定的雙價載體，不能構建出可以表達任意目的基因的通用載體。

發明內容

本發明是為了解決現有構建載體的方法不能構建出可以表達任意目的基因的通用載體的問題，而提供一種構建酵母雙價通用表達載體的方法。

本發明構建酵母雙價通用表達載體的方法按照以下步驟進行：一、根據酵母表達載體pYES2序列分別設計引物PGAL1-S、PGAL1-A、CYC1-S和CYC1-A，以質粒pYES2為模板、PGAL1-S和PGAL1-A為引物進行PCR擴增獲得基因片段PGAL1，以質粒pYES2為模板、CYC1-S和CYC1-A為引物進行PCR擴增獲得基因片段CYC1；二、將步驟一獲得的基因片段PGAL1采用TA克隆方法(Original?TA?Cloning?Kit)連接到pMD18-T載體，得到質粒pMD18-PGAL1；三、將步驟一獲得的基因片段CYC1和步驟二得到的質粒pMD18-PGAL1分別進行BamHI和XbaI雙酶切后回收目的片段CYC1和質粒pMD18-PGAL1進行連接，獲得質粒pMD18-PC；四、以步驟三得到的質粒pMD18-PC為模板、PGAL1-A和CYC1-S為引物進行PCR擴增，將擴增得到的目的片段和質粒pYES2分別用BamHI和EcoRI進行雙酶切，雙酶切后回收目的片段和質粒pYES2并連接；獲得酵母雙價通用表達載體pYES2-PC；其中步驟一中引物PGAL1-S的序列為5′-ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAG-3′，引物PGAL1-A的序列為5′-CCGGAATTCGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3′，引物CYC1-S的序列為5′-CGCGGATCCATCATGTAATTAGTTATGTCACG-3′，引物CYC1-A的序列為5′-TGCTCTAGAAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG-3′。

用本發明的方法構建出的通用雙價載體能夠準確表達連接的基因，只需要將目的基因片段直接連接在本發明構建的通用雙價表達載體上就可以準確表達，用本發明的方法構建出的通用雙價載體構建表達兩個目的基因片段的載體不需要中間載體，提高了構建雙價表達載體的效率，節約了構建雙價表達載體的時間，節約30％～40％的構建時間。

附圖說明