[發明專利]一種構建酵母雙價通用表達載體的方法

無效

• 申請號: 200810209569.3
• 申請日: 2008-11-28
• 公開（公告）號: CN101407823A
• 公開（公告）日: 2009-04-15
• 發明（設計）人: 劉關君;劉桂豐;楊傳平;劉明坤;閻秀峰;許志茹;魏志剛;王柏臣
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所
• 代理人: 榮 玲

1.一種構建酵母雙價通用表達載體的方法，其特征在于構建酵母雙價通用表達載體的方法按照以下步驟進行：一、根據酵母表達載體pYES2序列分別設計引物PGAL1-S、PGAL1-A、CYC1-S和CYC1-A，以質粒pYES2為模板、PGAL1-S和PGAL1-A為引物進行PCR擴增獲得基因片段PGAL1，以質粒pYES2為模板、CYC1-S和CYC1-A為引物進行PCR擴增獲得基因片段CYC1；二、將步驟一獲得的基因片段PGAL1采用TA克隆方法連接到pMD18-T載體，得到質粒pMD18-PGAL1；三、將步驟一獲得的基因片段CYC1和步驟二得到的質粒pMD18-PGAL1分別進行BamHI和XbaI雙酶切后回收目的片段CYC1和質粒pMD18-PGAL1進行連接，獲得質粒pMD18-PC；四、以步驟三得到的質粒pMD18-PC為模板、PGAL1-A和CYC1-S為引物進行PCR擴增，將擴增得到的目的片段和質粒pYES2分別用BamHI和EcoRI進行雙酶切，雙酶切后回收目的片段和質粒pYES2并連接；獲得酵母雙價通用表達載體pYES2-PC；其中步驟一中引物PGAL1-S的序列為5′-ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAG-3′，引物PGAL1-A的序列為5′-CCGGAATTCGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAA-3′，引物CYC1-S的序列為5′-CGCGGATCCATCATGTAATTAGTTATGTCACG-3′，引物CYC1-A的序列為5′-TGCTCTAGAAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG-3′。

2.根據權利要求1所述的構建酵母雙價通用表達載體的方法，其特征在于步驟一中以質粒pYES2為模板、PGAL1-S和PGAL1-A為引物進行PCR擴增的體系為20μL，由14μL的去離子水、2μL的10×Taq緩沖液、0.5μL濃度為10mmol/L的dNTP、1μL濃度為10mmol/L的引物PGAL1-S、1μL濃度為10mmol/L的引物PGAL1-A、0.5μL濃度為2.5U/μL的Taq?DNA聚合酶和1μL的質粒pYES2組成；PCR反應條件：預變性94℃1min，變性94℃0.5min、退火57℃0.5min、延伸72℃1min，共38個循環，延伸72℃7min。

3.根據權利要求1所述的構建酵母雙價通用表達載體的方法，其特征在于步驟一中以質粒pYES2為模板、CYC1-S和CYC1-A為引物進行PCR擴增的體系為20μL，由14μL的去離子水、2μL的10×Taq緩沖液、0.5μL濃度為10mmol/L?dNTP、1μL濃度為10mmol/L的引物CYC1-S、1μL濃度為10mmol/L的引物CYC1-A、0.5μL濃度為2.5U/μL的Taq?DNA聚合酶和1μL的質粒pYES2組成；PCR反應條件：預變性94℃1min，變性94℃0.5min、退火57℃0.5min、延伸72℃1min，共38個循環，延伸72℃7min。

4.根據權利要求1所述的構建酵母雙價通用表達載體的方法，其特征在于步驟三中質粒pMD18-PGAL1進行BamHI和XbaI雙酶切的體系為20μL，由1μL的BamHI、1μL的XbaI、2μL的10×M緩沖液、10μL濃度為0.1g/L的質粒pMD18-PGAL1和余量的去離子水組成；雙酶切的反應是在37℃的條件下反應10～14小時。

5.根據權利要求1所述的構建酵母雙價通用表達載體的方法，其特征在于步驟三中基因片段CYC1進行BamHI和XbaI雙酶切的體系為20μL，由1μL的BamHI、1μL的XbaI、2μL的10×M緩沖液、10μL濃度為0.1g/L的基因片段CYC1和余量的去離子水組成；雙酶切反應的條件為在37℃的條件下反應10～14小時。

6.根據權利要求1所述的構建酵母雙價通用表達載體的方法，其特征在于步驟三中將回收的目的片段CYC1和質粒pMD18-PGAL1用T₄連接酶進行連接；連接體系20μL，由2μL的10×T₄DNA連接酶緩沖液、1μL濃度為2.5U/μL的T₄DNA連接酶、4μL濃度為0.1g/L的回收的目的片段CYC1、4μL濃度為0.1g/L的回收的質粒pMD18-PGAL1和余量的去離子水組成；連接反應條件為在4℃的條件下反應10～14小時。