[發(fā)明專(zhuān)利]環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810209551.3
• 申請(qǐng)日: 2008-11-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101748201A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李蘇龍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中華人民共和國(guó)黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 哈爾濱東方專(zhuān)利事務(wù)所 23118
• 代理人: 陳曉光

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌。

背景技術(shù)：

目前，對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)主要有標(biāo)準(zhǔn)方法、生化儀器法(API，VETEK)、 酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)法(VIDAS)、膠體金試紙法、PCR法、基因芯片法等。微 生物的傳統(tǒng)檢測(cè)方法除操作繁瑣外，檢驗(yàn)時(shí)間也較長(zhǎng)，一般需要5-15天的培養(yǎng) 鑒定時(shí)間，時(shí)間上不能滿(mǎn)足快速檢測(cè)的要求。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)的 不斷發(fā)展，人們已創(chuàng)建了不少快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感致病菌檢測(cè)方法。免疫 學(xué)方法簡(jiǎn)單快速，但靈敏性差，假陽(yáng)性高；分子生物學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)單快速，靈敏度 高，但設(shè)備投入高，不易推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)方便、快捷的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)單核 細(xì)胞增生李斯特菌。

上述的目的通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌，其組成包括：預(yù)處理、 選擇單核細(xì)胞增生李斯特菌的靶基因、檢測(cè)過(guò)程、結(jié)果檢測(cè)、結(jié)果判斷，選擇 單核細(xì)胞增生李斯特菌的靶基因(GenBank登陸號(hào)：AF532235)，設(shè)計(jì)2對(duì)引物：

內(nèi)引物為：FIP：TTAGGCGCAGGTGTAGTTGC?CTGCTGCAGAAACAAAAACTGAA

??????????BIP：GATCAAAATGCTACTACACACGCTG?CCGTATTTTACGGATAAAGCCCA

外引物為：F3：ACACAAGAAGTGAAAAAAGAAAC

??????????B3：ACATAATGTCTTGAACAGAAACA

通過(guò)提供特異性的引物組，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的核酸進(jìn)行LAMP基因 擴(kuò)增，檢測(cè)樣品中是否存在特定基因片段，進(jìn)而確定樣品中是否存在單核細(xì)胞 增生李斯特菌。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌，其組成包括：預(yù)處理、 檢測(cè)過(guò)程、結(jié)果檢測(cè)、結(jié)果判斷，所述的檢測(cè)過(guò)程是將22.5μLLAMP反應(yīng)液、 0.5μLBst酶，DNA(單核細(xì)胞增生李斯特菌)加入到潔凈的1.5mL離心管中， 混合均勻，以2000r/min轉(zhuǎn)速離心10sec，向一組反應(yīng)管中分別加入22.5μL上 述反應(yīng)液，向PCR反應(yīng)管內(nèi)按順序分別加入陰性對(duì)照、待檢模板和陽(yáng)性對(duì)照 各2μL，蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，置65℃恒溫反應(yīng)60min。

所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌，所述的預(yù)處理是 將環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增LAMP反應(yīng)液在使用前在室溫融化振蕩混勻后，以2000r/min 轉(zhuǎn)速離心10sec，其余室溫融化后，以2000r/min轉(zhuǎn)速離心10sec。

所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌，所述的結(jié)果檢測(cè) 是取出反應(yīng)管，冷卻至室溫，以2000r/min轉(zhuǎn)速離心10sec，觀看是否有沉淀或 分別加入1μL顯色液，輕輕混勻，在黑色背景下觀察顏色變化或電泳檢測(cè)。

所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌，所述的結(jié)果判斷 在陰性對(duì)照反應(yīng)管液體為橙色，陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管液體呈綠色的條件下：待檢樣 品反應(yīng)管液體呈綠色，該樣品結(jié)果為單核增生李斯特氏菌陽(yáng)性；待檢樣品反應(yīng) 管液體呈橙色則可報(bào)告單核增生李斯特氏菌檢驗(yàn)結(jié)果為陰性；若陰陽(yáng)性對(duì)照反 應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重新檢測(cè)。

所述的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌，所需LAMP反應(yīng) 管數(shù)的計(jì)算方法為：設(shè)LAMP反應(yīng)管數(shù)為n，則n＝樣品數(shù)+1(陽(yáng)性對(duì)照)+1(陰 性對(duì)照)+1。

這個(gè)技術(shù)方案有以下有益效果：