[發明專利]一種檢測核酸點突變的方法

無效

• 申請號: 200810208117.3
• 申請日: 2008-12-29
• 公開（公告）號: CN101768628A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 姚見兒;白艷軍;談暢;李久彤
• 申請（專利權）人: 上海透景生命科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 徐迅

技術領域

本發明涉及核酸診斷技術領域，具體地涉及一種檢測核酸點突變的方法。更具體地，涉及一種利用寡核苷酸探針對PCR產物進行反向雜交以檢測核酸點突變的方法，采用本發明方法可以有效提高檢測信噪比從而提高檢測靈敏度。

背景技術

反向雜交是進行核酸檢測的重要技術方法，廣泛用于可進行高通量檢測的芯片類技術。

反向雜交的基本原理是首先將寡核苷酸探針共價交鏈在一定的固相載體表面，如膜條、微球(如不同熒光微球)等；然后將PCR擴增產物和寡核苷酸混和，在一定的雜交體系中，寡核苷酸探針和目標序列按照堿基互補的原則發生特異性的識別和結合；最后經過一定的酶促或熒光等信號放大過程，最終獲得檢測信號并依次判定被檢測的目標產物是否存在及濃度高低。

反向雜交技術應用于點突變檢測時遇到的一個最大的難題就是寡核苷酸探針針對突變型和野生型目標序列檢測的信號比較接近，因此無法明確或有效地判定檢測結果。

因此，本領域迫切需要開發能夠更明確地判定核酸點突變的檢測方法。

發明內容

本發明的目的就是提供一種更明確地判定核酸點突變的檢測方法。

具體地，本發明提供了一種新的寡核苷酸探針的序列設計方法，使得在反向雜交檢測核酸點突變時，探針針對野生型和突變型得檢測信號產生明顯得區別，從而可以明確判定檢測結果。

在本發明的第一方面，提供了一種用于檢測核酸點突變的探針，所述探針的結構如式I所示：

Z-L-B????(式I)

式中，

B表示探針與靶核酸結合的核酸結合區；

Z表示可有可無的固相載體；

L是連接臂；當Z不存在時，L是用于將B連接于Z的連接臂；當Z存在時，L是已經將B與Z相連的連接臂；

并且，所述的探針與靶核酸結合的結合區B具有式II所示的5’-3’結構：

S1-P1-S2-P2-S3????(式II)

式中，

P1和P2分別是一個堿基，其中的一個是針對突變位點的堿基，該堿基與野生型序列互補但與突變型序列不互補，或者該堿基與野生型序列不互補但與突變型序列互補；而另一個是輔助性的不匹配堿基，該堿基既與野生型序列不互補，也與突變型序列不互補；

S1是與野生型序列和突變型序列互補的結合區5’端核苷酸序列，其長度為X1個堿基；

S2是與野生型序列和突變型序列互補的結合區中部核苷酸序列，其長度為X2個堿基；

S3是與野生型序列和突變型序列互補的結合區3’端核苷酸序列，其長度為X3個堿基；

其中，X1、X2和X3的長度差的絕對值同時滿足以下條件：

|X1-X2|≤4；

|X3-X2|≤4；

|X1-X3|≤4；

并且|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤8。

在另一優選例中，|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤6，更佳地|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|≤4，最佳地|X1-X2|+|X3-X2|+|X1-X3|＝0。

在另一優選例中，X1、X2和X3的長度差的絕對值同時滿足以下條件：

|X1-X2|≤3；

|X3-X2|≤3；

|X1-X3|≤3。

在另一優選例中，X1、X2和X3的長度差的絕對值同時滿足以下條件：

|X1-X2|≤2；

|X3-X2|≤2；

|X1-X3|≤2。

在另一優選例中，所述的探針與靶核酸結合的結合區B的長度為15-25個堿基，更佳地為16-22個堿基。

在另一優選例中，所述的連接臂的長度為8-30個堿基。

在另一優選例中，連接臂為10～20聚體的polyT。

在另一優選例中，所述的固相載體是熒光編碼微球、膜條或玻片。

在另一優選例中，所述的探針的結合區序列如SEQ?ID?NO：7-13所示。

在本發明的第二方面，提供了一種檢測核酸樣品是否存在點突變的檢測方法，包括步驟：

將本發明第一方面中所述的探針與待檢測核酸樣品進行雜交，并檢測是否形成“待檢測核酸-探針”雜交復合物，其中未形成所述的雜交復合物就表示樣品存在所述的點突變，而形成所述的雜交復合物就表示樣品存在所述的點突變。

在另一優選例中，該方法還包括將檢測結果與陽性對照和陰性對照進行比較。