[發(fā)明專利]人源乙肝病毒表面抗體的制備方法

無效

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• 申請日: 2008-12-04
• 公開（公告）號: CN101748129A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 穆海東;汪寧梅;穆宇豪;黎颯
• 申請（專利權）人: 上海裕隆臨床檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/63;C07K16/08
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技術領域

本發(fā)明涉及一種抗體制備方法，具體的說，涉及一種針對乙肝病毒的表面抗體的制備方法。

背景技術

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計，全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者(HBsAg攜帶者)超過2.8億，我國約占9300萬。多數(shù)無癥狀，其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)。目前我國有乙肝患者3000萬。乙肝的特點為起病較緩，以亞臨床型及慢性型較常見。

正因為乙型肝炎的廣泛性和危害性，人們長期以來一直在研究乙肝的診斷、預防和治療。目前乙肝兩對半是國內(nèi)醫(yī)院最常用的乙肝病毒(HBV)感染檢測血清標志物。乙型肝炎病毒免疫學標記一共3對，即表面抗原(HBsAg)和表面抗體(抗HBs或HBsAb)、e抗原(HBeAg)和e抗體(抗HBe或HBeAb)、核心抗原(HBcAg)和核心抗體(抗HBc或HBcAb)。

兩對半檢查是用來判斷是否感染乙肝或粗略估計病毒復制水平的初步檢查，兩對半對于乙肝診斷的有很大評估參考性。

乙肝兩對半包括：

1、HBsAg(表面抗原)，為已經(jīng)感染病毒的標志，并不反映病毒有無復制、復制程度、傳染性強弱；

2、HBsAb(表面抗體)，為中和性抗體標志，是是否康復或是否有抵抗力的主要標志。乙肝疫苗接種者，若僅此項陽性，應視為乙肝疫苗接種后正常現(xiàn)象；

3、HBeAg(e抗原)，為病毒復制標志。持續(xù)陽性3個月以上則有慢性化傾向；

4、HBeAb(e抗體)，為病毒復制停止標志。病毒復制減少，傳染性較弱，但并非完全沒有傳染性；

5、HBcAb(核心抗體)，為曾感染過或正在感染者都會出現(xiàn)的標志。核心抗體IgM是新近感染或病毒復制標志，核心抗體IgG是感染后就會產(chǎn)生的，對于輔助兩對半檢查有一定意義。

血清中HBsAg陽性是HBV感染的標志。HBsAg本身具有抗原性，無傳染性，但由于HBsAg常與HBV同時存在，故認為是傳染性標志之一。HBsAb是兩對半的檢測指標，同時也是用來檢測HBsAg的底物，故對于乙肝病毒檢測有十分重要的意義；另外HBsAb在制備乙肝疫苗上也有很大幫助。因此人們一直在研究制備HBsAb。

早期的多克隆抗體制備法是直接用抗原(具有多個抗原決定簇)免疫動物獲得血清抗體。這種抗體雖然制備比較方便，但是往往特異性差，濃度低，針對多個抗原決定簇，易出現(xiàn)交叉反應，所以使用范圍有限。到了70年代人們發(fā)展出了單克隆抗體制備法，利用小鼠進行B細胞雜交瘤技術，特異性地制備針對單一抗原決定簇的抗體。雖然這種方法較多克隆抗體技術有了很大的進步，但是這種方法有三個缺陷：1、只能制備鼠源的抗體，在人體使用會引起人抗小鼠抗體反應。2、對于特異性抗原決定簇較少的疾病，就比較難制備單克隆抗體，容易出現(xiàn)交叉反應。3、這種技術操作繁瑣。

隨著基因工程技術的發(fā)展，制備特異性更高、結合能力更強、純度更高的抗體成為可能。人們對Ig基因結構與功能深入剖析，結合DNA重組技術，對免疫蛋白(Ig)分子進行切割、拼接或修飾，甚至是人工全合后導入受體細胞表達，產(chǎn)生新型抗體，這種抗體制備方法稱為第三代抗體制備法。本發(fā)明正是在第三代抗體制備法的基礎上，采用了多種基因工程技術，提供一種新型的制備人源乙肝病毒表面抗體的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種人源乙肝病毒表面抗體的新制備方法，以克服傳統(tǒng)多克隆抗體制備技術制備的乙肝病毒表面抗體不純；而用單克隆抗體技術制備的抗體由于其鼠源特性在人體會產(chǎn)生較大排斥，同時又很難全面反映體內(nèi)免疫反應情況的復雜性，導致制備的抗體針對性不強的缺點；提供一種采用基因工程技術，制備出高特異性、高純度、高結合性的人源乙肝病毒表面抗體的方法。

本發(fā)明提供的方法步驟如下：

(1)使用乙肝患者外周血，分離淋巴細胞，提取它們的總RNA為模版；

(2)用建立噬菌體文庫所設計的引物，擴增抗體的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因；所述的輕鏈可變區(qū)基因包括κ鏈基因和λ鏈基因；

(3)用得到的擴增產(chǎn)物構建重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因的噬菌體載體，經(jīng)轉化培養(yǎng)獲得噬菌體文庫；

(4)用乙肝病毒表面抗原包被的酶標板篩選表達特異性乙肝表面抗體的噬菌體；

(5)以雙酶切剔出篩選所得的噬菌體載體上的gIII基因(一個決定噬菌體是否進入裂解途徑的關鍵基因)，從而得到可溶性的表達載體；

(6)轉化大腸桿菌后誘導表達，獲取高特異性的抗體。

所述的建立噬菌體文庫所需的引物序列如下：