[發明專利]一種人細胞色素c的制備方法

無效

• 申請號: 200810202928.2
• 申請日: 2008-11-18
• 公開（公告）號: CN101736005A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: 應天雷;謝琎;鐘方芳;王中華;馮彥嬌;黃仲賢;譚相石
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/80
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴;包兆宜

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種用生物工程高效制備人細胞色素c的方法。

背景技術

多年來人們一直認為細胞色素c只是一種電子傳遞蛋白，對其研究工作多集中于馬心細胞色素c與酵母細胞色素c等。人細胞色素c由于來源困難，研究極少。但是近年來，人們發現細胞色素c與細胞凋亡以及細胞氧化壓力有著重大關系。這兩個過程與目前困擾人類的多種重大疾病，如癌癥、帕金森癥等都有著直接關聯。因此，人細胞色素c對于生物醫藥領域有著重要的潛在應用價值。

現有技術一直難以得到高純度的全長人細胞色素c。首先，人基因組中有至少49條細胞色素c的假基因，這使得人細胞色素c的cDNA克隆非常困難。另外，細胞色素c蛋白的合成過程中還需要其它酶的輔助，從而將血紅素輔基共價連接到肽鏈上。這些都給人們制備細胞色素c全蛋白帶來了很大困擾。Jeng等曾于2002年在酵母細胞色素c的基礎上進行基因改造，制備出N端甲硫氨酸缺失的人細胞色素c蛋白，產量約10-15mg/L菌液。Olteanu等于2003年在馬心細胞色素c的基礎上進行基因改造，得到的是N端甲硫氨酸缺失的以及全長細胞色素c蛋白的混合蛋白，全長細胞色素c蛋白僅占總蛋白的1/10，總產量約8mg/L。目前還沒有高產量的全長細胞色素c蛋白制備方法的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種操作簡單，成本較低，產率高，純度高的全長人細胞色素c的制備方法。

本發明提供了一種人細胞色素c的制備方法，包括人細胞色素c核苷酸編碼序列與表達載體連接構建重組質粒，然后轉化基因工程菌培養擴增并分離純化，基因工程菌擴增時接種于含2-4克/升的SB培養液。

本發明的方法中，所述表達載體可以是pBTR1或者pBTR2。

本發明的方法中，所述表達載體可以是pBTR-fd質粒。

本發明的方法中，所述基因工程菌可以是Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)或者BL21(DE3)pLysS。

本發明的方法中，基因工程菌擴增溫度可以為35-40度，時間可以為18-28小時。

本發明的方法中，所述分離純化過程可以是將擴增培養后的菌體依次經過超聲破菌，離心，鹽析，透析，過柱和脫鹽過程。

本發明的方法中，所述過柱可以是上清液通過CM-52陽離子交換柱，再通過CM-瓊脂糖高通量陽離子交換柱或者葡聚糖凝膠樹脂柱(或Mono-S柱)。

本發明的方法中，擴增培養時，培養液可以用塑料膜封口。

本發明的方法中，“人細胞色素c核苷酸編碼序列”是指編碼具有人細胞色素c的核苷酸序列NM_018947，如序列中開放閱讀框位置的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于NM_018947序列的編碼框開放閱讀框位置核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與NM_018947序列的編碼框開放閱讀框位置位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出NM_018947所述的序列。

在本發明中，術語“人細胞色素c核苷酸編碼序列”指具有人細胞色素c活性的上述編碼序列對應的多肽。該術語還包括具有與上述蛋白具有相同功能的變異形式。這些變異形式包括：若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人細胞色素c的活性片段和活性衍生物。

該多肽的變異形式還包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、人細胞色素c核苷酸的融合蛋白、以及利用抗人細胞色素c核苷酸血清獲得的多肽或蛋白。

本發明的方法中采用的表達載體和菌株可以采用該領域常用的表達載體和宿主菌，例如pBTR-fd質粒和大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS，pBTR1和Rosetta(DE3)，pBTR2和BL21(DE3)pLysS。

把人細胞色素c編碼序列裝入載體并轉化菌株可以采用常規的方法。例如，在人細胞色素c編碼序列5‘和3’加入載體上已有的酶切位點，從而將編碼序列插入載體的多克隆位點處。轉化可采用熱激轉化。