[發(fā)明專利]一種人細(xì)胞色素c的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810202928.2
• 申請日: 2008-11-18
• 公開（公告）號: CN101736005A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 應(yīng)天雷;謝琎;鐘方芳;王中華;馮彥嬌;黃仲賢;譚相石
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K14/80
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 吳桂琴;包兆宜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種用生物工程高效制備人細(xì)胞色素c的方法。

背景技術(shù)

多年來人們一直認(rèn)為細(xì)胞色素c只是一種電子傳遞蛋白，對其研究工作多集中于馬心細(xì)胞色素c與酵母細(xì)胞色素c等。人細(xì)胞色素c由于來源困難，研究極少。但是近年來，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素c與細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞氧化壓力有著重大關(guān)系。這兩個過程與目前困擾人類的多種重大疾病，如癌癥、帕金森癥等都有著直接關(guān)聯(lián)。因此，人細(xì)胞色素c對于生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要的潛在應(yīng)用價值。

現(xiàn)有技術(shù)一直難以得到高純度的全長人細(xì)胞色素c。首先，人基因組中有至少49條細(xì)胞色素c的假基因，這使得人細(xì)胞色素c的cDNA克隆非常困難。另外，細(xì)胞色素c蛋白的合成過程中還需要其它酶的輔助，從而將血紅素輔基共價連接到肽鏈上。這些都給人們制備細(xì)胞色素c全蛋白帶來了很大困擾。Jeng等曾于2002年在酵母細(xì)胞色素c的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因改造，制備出N端甲硫氨酸缺失的人細(xì)胞色素c蛋白，產(chǎn)量約10-15mg/L菌液。Olteanu等于2003年在馬心細(xì)胞色素c的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因改造，得到的是N端甲硫氨酸缺失的以及全長細(xì)胞色素c蛋白的混合蛋白，全長細(xì)胞色素c蛋白僅占總蛋白的1/10，總產(chǎn)量約8mg/L。目前還沒有高產(chǎn)量的全長細(xì)胞色素c蛋白制備方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，成本較低，產(chǎn)率高，純度高的全長人細(xì)胞色素c的制備方法。

本發(fā)明提供了一種人細(xì)胞色素c的制備方法，包括人細(xì)胞色素c核苷酸編碼序列與表達(dá)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化基因工程菌培養(yǎng)擴(kuò)增并分離純化，基因工程菌擴(kuò)增時接種于含2-4克/升的SB培養(yǎng)液。

本發(fā)明的方法中，所述表達(dá)載體可以是pBTR1或者pBTR2。

本發(fā)明的方法中，所述表達(dá)載體可以是pBTR-fd質(zhì)粒。

本發(fā)明的方法中，所述基因工程菌可以是Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)或者BL21(DE3)pLysS。

本發(fā)明的方法中，基因工程菌擴(kuò)增溫度可以為35-40度，時間可以為18-28小時。

本發(fā)明的方法中，所述分離純化過程可以是將擴(kuò)增培養(yǎng)后的菌體依次經(jīng)過超聲破菌，離心，鹽析，透析，過柱和脫鹽過程。

本發(fā)明的方法中，所述過柱可以是上清液通過CM-52陽離子交換柱，再通過CM-瓊脂糖高通量陽離子交換柱或者葡聚糖凝膠樹脂柱(或Mono-S柱)。

本發(fā)明的方法中，擴(kuò)增培養(yǎng)時，培養(yǎng)液可以用塑料膜封口。

本發(fā)明的方法中，“人細(xì)胞色素c核苷酸編碼序列”是指編碼具有人細(xì)胞色素c的核苷酸序列NM_018947，如序列中開放閱讀框位置的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于NM_018947序列的編碼框開放閱讀框位置核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與NM_018947序列的編碼框開放閱讀框位置位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出NM_018947所述的序列。

在本發(fā)明中，術(shù)語“人細(xì)胞色素c核苷酸編碼序列”指具有人細(xì)胞色素c活性的上述編碼序列對應(yīng)的多肽。該術(shù)語還包括具有與上述蛋白具有相同功能的變異形式。這些變異形式包括：若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人細(xì)胞色素c的活性片段和活性衍生物。

該多肽的變異形式還包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、人細(xì)胞色素c核苷酸的融合蛋白、以及利用抗人細(xì)胞色素c核苷酸血清獲得的多肽或蛋白。

本發(fā)明的方法中采用的表達(dá)載體和菌株可以采用該領(lǐng)域常用的表達(dá)載體和宿主菌，例如pBTR-fd質(zhì)粒和大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS，pBTR1和Rosetta(DE3)，pBTR2和BL21(DE3)pLysS。

把人細(xì)胞色素c編碼序列裝入載體并轉(zhuǎn)化菌株可以采用常規(guī)的方法。例如，在人細(xì)胞色素c編碼序列5‘和3’加入載體上已有的酶切位點(diǎn)，從而將編碼序列插入載體的多克隆位點(diǎn)處。轉(zhuǎn)化可采用熱激轉(zhuǎn)化。