[發明專利]雙效蛭弧菌的發酵生產工藝

無效

• 申請號: 200810202809.7
• 申請日: 2008-11-17
• 公開（公告）號: CN101508963A
• 公開（公告）日: 2009-08-19
• 發明（設計）人: 邱軍強
• 申請（專利權）人: 邱軍強
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/63
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及發酵技術領域，具體涉及雙效蛭弧菌的發酵生產工藝。

背景技術

國內外在水產養殖及動物疾病防治中，目前主要使用抗生素等化學制劑。這些制劑的副作用，如藥物殘留、病原菌的抗藥性、抑制有益菌群等，給人類健康及畜牧業生產帶來的不良影響越來越明顯。

近年來微生物生態制劑的研究開發受到各方關注，特別是噬菌蛭弧菌的研究受到人們的青睞。噬菌蛭弧菌自1963年被發現以來，因其是一種寄生菌，能裂解大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、弧菌等動物致病菌，可將致病菌數量限制在較低水平，同時又可以有效地控制養殖水體的COD、硫化物和氨氮等的含量，而其本身對人和動物無毒無害，還可以改善水環境等，日益受到人們的關注。因此，利用它作為養殖水體環境中的天然生物凈化因子和“活性抗生素”，對開拓水產動物病害生物防治新途徑具有重要的意義。

在研究開發中，人們都用大腸桿菌作為宿主菌。用活的大腸桿菌培養生產噬菌蛭弧菌，受多種技術條件的限制，很難進行大規模工業化生產，同時影響生態環境。因而有人提出用高溫(高于150℃)或化學藥物(氯仿等)將大腸桿菌殺死，制造滅活的宿主菌，用來生產噬菌蛭弧菌。實踐證明，用這種方法生產的成品的噬菌蛙弧菌含量都低于1×10⁶pfu/mL，保存3～6個月后，含量下降超過2個數量級，會降低噬菌蛭弧菌對活的宿主菌的裂解能力，甚至降到無裂解能力，因此，對防治動物細菌性疾病效果不穩，同時該制劑保存時間短，使制劑開發應用受到限制，在水產養殖中更受到制約。

發明內容

本發明所要解決的技術問題提供了一種雙效蛭弧菌發酵生產工藝，以克服現有工藝所生成的的噬菌蛭弧菌含量低、保存期短的問題。

為此，本發明提供了一種雙效蛭弧菌發酵生產工藝，包括下列步驟：

d)宿主菌混懸液的制備：

e)配制培養液：將pH6.5-8.0的磷酸鹽緩沖液用水10倍稀釋，然后加入CaCl₂和MgCl₂制成培養液，培養液中CaCl₂和MgCl₂含量均為10-100mg/L；

f)雙效蛭弧菌的發酵：在所制成的培養液中，加入與培養液體積比為5％-30％的由步驟a制備的宿主菌混懸液，再加入與已加宿主菌混懸液的培養液體積比為2-3％的噬菌蛭弧菌液(含菌量大于10⁵pfu/ml)，在28-30℃溫度條件下培養72-120小時，即制成雙效蛭弧菌。

步驟a中所述宿主菌可為大腸桿菌、非致病性的嗜水氣單胞菌或假單胞菌中之一。

步驟a中所述宿主菌為大腸桿菌時，發酵培養基含有下列重量份組分：氯化鈉0.2，酵母粉0.1，蛋白胨0.2，消泡劑0.2；用氫氧化鈉調pH6.5～6.8；定容至700L按0.1MPa121℃控制20min滅菌；發酵培養條件：接入大腸桿菌種子液約2000ml，控制罐溫37±1℃，通氣，控制罐壓0.05MPa，培養24～30hr。

步驟a中最后制得的宿主菌混懸液的含菌量為E6以上。

步驟b培養液中加入少量的CaCl₂和MgCl₂有助于促進后面的噬菌蛭弧菌的生長，且培養液中的優選含量為50mg/L：同時pH6.5-8.0的磷酸鹽緩沖液可以是PBS。

本工藝生產的蛭弧菌含量可以達到5×10⁸pfu/mL以上，而一般的廠家出來的成品含量都低于1×10⁶pfu/mL；而保藏時間上：一般廠家的蛭弧菌保存3～6個月后，含量下降超過2個數量級；本工藝生產的產品保存12個月之內數量級不會下降，保存24月個之內，也只下降1個數量級。

具體實施方式

以下結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。

實施例1：

宿主細菌大腸桿菌的培養

1.大腸桿菌斜面種子培養

固體培養基(普通營養肉湯培養基)：蛋白胨0.5，牛肉膏3.0，氯化鈉0.5，瓊脂1.8，pH7.0～7.2。

斜面種子培養條件：37±1℃培養24～36hr。

2.搖瓶種子培養