[發(fā)明專利]環(huán)介導恒溫擴增檢測米氏凱倫藻的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810202511.6
• 申請日: 2008-11-10
• 公開（公告）號: CN101736079A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發(fā)明（設計）人: 馬凌波;張鳳英;徐兆禮
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院東海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海東方易知識產權事務所 31121
• 代理人: 歐陽俊立

技術領域

本發(fā)明涉及赤潮生物米氏凱倫藻的檢測。

背景技術

米氏凱倫藻(Karenia?mikimotoi)能產生溶血性(hemolytic)毒素和魚毒(ichthyotoxins)，能夠溶解魚類細胞，破壞魚鰓組織結構，使魚類無法正常呼吸而窒息死亡。由米氏凱倫藻引起的赤潮在墨西哥灣、新西蘭、韓國、蘇格蘭、澳大利亞、日本海域都有發(fā)生，2002-2005年在中國福建浙江沿海引發(fā)多次赤嘲，對漁業(yè)造成巨大經濟損失，研究米氏凱倫藻赤潮，進行赤潮的預測預報，對于減少水產養(yǎng)殖業(yè)損失，保護海洋生態(tài)環(huán)境，有著重要的實際意義。

對赤潮進行預測首要問題是對引起赤潮的藻類進行檢測，傳統(tǒng)的藻類鑒定是通過形態(tài)學的觀察來劃分的，從色素，色素體，貯藏物質等的差別來辨別不同種的藻類細胞，這是一件費時費力的事，而且不同的種屬差別很細微，非長期從事該工作的專業(yè)人員難以勝任這項工作，并且環(huán)境對藻類的形態(tài)有很大的影響，鑒定到種存在的困難較多。

目前，利用分子生物學手段檢測微藻的方法日漸成熟，這些方法從分子水平解決了某些從形態(tài)上難以區(qū)分的藻類分類和鑒定問題。自從聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)發(fā)明以來，這種技術就被應用到諸多領域。許多學者通過微藻某些基因片段擴增能夠對藻類進行鑒定，例如通過對核糖體rDNA序列分析，核糖體間隔區(qū)(ITS)的PCR擴增和測序，從而完成對微藻類的種類鑒定，然而這種方法對儀器要求較高，而且所需時間長，一個檢測反應需要3小時左右。熒光原位雜交也是近年來微藻鑒定的檢測手段，有學者利用核糖體大亞基(LSU)分子探針對墨西哥灣短凱倫藻進行了鑒定，但是這種技術實驗材料費用較高。實時熒光定量PCR檢測也是近年來微藻檢測一個方向，這種方法非常靈敏，所需時間也不長(大約一個多小時)，但是所需的實驗儀器(熒光定量PCR儀)價格昂貴。

2000年，日本學者Notomi等開發(fā)了一種恒溫核酸擴增方法，即環(huán)介導等溫擴增反應(Loop-mediated?isothermal?amplificatiom，LAMP)，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)在等溫條件下保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。此反應不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，而且結果判定簡單，既可以利用儀器檢測或肉眼觀察核酸擴增過程中產生的焦磷酸鎂沉淀判定，也可以采用肉眼觀察反應液的顏色變化來迅速判定。與以上的檢測方法相比，LAMP雖然需要引物多，實驗條件需要摸索，但只要在優(yōu)化好實驗條件的前提下，因其操作簡單快速、對儀器要求不高、特異性強、擴增效率高、結果判定簡單等優(yōu)點適合快速鑒定和現(xiàn)場檢測。這種技術已廣泛應用到病原菌檢測方面，取得理想的檢測效果。

發(fā)明內容

本發(fā)明需要解決的技術問題是提供一種針對赤潮生物米氏凱倫藻的檢測方法。

本發(fā)明的技術方案首先提取微藻基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增，PCR擴增后對產物進行測序，其特征是針對米氏凱倫藻核糖體間隔區(qū)的6個區(qū)域設計4條特異性引物，根據LAMP產物產生白色焦磷酸鎂沉淀或根據LAMP產物與SYBR?Green?I反應呈現(xiàn)綠色判斷為米氏凱倫藻，所述的4條特異性引物序列如下：

引物Primer?????序列Sequence(5’-3’)

F3?????????????CTGTCATCTTGTCATGTGC；

B3?????????????CTAACTTCATGTCATGGAAGG；

FIP(Flc+F2)????TTCAATGCATCAGGGGCAGG-GCAACTGACAGCAGTGTG；

BIP(Blc+B2)????ACACCTTGTGCTTTGTGTGT-TGAAGTGGCAGACAGGAG；

2個內引物FIP和BIP的濃度均為1.6μM，兩個外引物F3和B3的濃度均為0.2μM，MgSO4濃度為6mM，dNTP濃度為0.6mM，Betaine濃度為0.6M，反應溫度為63℃，反應時間60min。