[發明專利]硫鏈絲菌素的生物合成基因簇

無效

• 申請號: 200810202416.6
• 申請日: 2008-11-07
• 公開（公告）號: CN101445803A
• 公開（公告）日: 2009-06-03
• 發明（設計）人: 劉文;廖日晶;虞沂;段煉;雷春;丁瑩
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海有機化學研究所
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/55;C12N15/52;C12N15/53;C12N15/31;C07K14/195
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 鄔震中

技術領域：

本發明屬于微生物基因資源和基因工程領域，具體涉及抗革蘭氏陽性菌抗生素硫鏈絲菌素(Thiostrepton)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其應用。

技術背景：

硫鏈絲菌素(Thiostrepton)是硫肽類抗生素家族的一個著名成員，可由鏈霉菌Streptomyces?laurentii?ATCC31255、Streptomyces?azureus?ATCC14921、Streptomyces?hawaiiensis?ATCC12236所產生。人們首次發現硫鏈絲菌素是在1954年，但是由于它結構十分復雜，直到1989年借助了X射線晶體衍射技術才最終闡明了其分子結構[J.Antibiot.1989，42，1649]。它含有兩個大環結構(分別為26員環和27員環)，4個噻唑環，1個噻唑啉，一個四取代的哌啶和一個喹萘啶酸結構，整個分子共有17個手性中心。前體標記實驗表明：其中噻唑、噻唑啉雜環來自于半胱氨酸，哌啶環由兩個絲氨酸經酶催化后形成，喹萘啶酸由色氨酸衍生而來。

硫鏈絲菌素具有良好的生物活性。它對革蘭氏陽性菌有廣譜而且強有力的抑制作用，特別是對多種耐藥性的條件致病菌具有極強的殺傷作用。硫鏈絲菌素抑制革蘭氏陽性菌的機制是因為它能與50S核糖體亞單元上的23S?rRNA-L11蛋白復合物結合，抑制延長因子的GTPase活性，從而抑制蛋白質的合成[J.Mol.Biol1998，276，391-401]。近年來還發現硫鏈絲菌素有抗瘧疾的活性，對人類瘧原蟲(Plasmodium?falciparum)的IC₅₀值達到了3.2nM[Protist，1999，150，189]，Jonghee等人還在2002年報道了硫鏈絲菌肽的抗癌活性[PCT?Int.Appl.WO?2002066046，2002.]但是，由于硫鏈絲菌素水溶性不好，生物利用度較低，大大限制了它的醫藥用途，目前只作為畜用抗生素。人們希望能獲得一些它的結構類似物，從中篩選出活性更好，更有利于實際使用的分子。由于硫鏈絲菌素極其復雜的分子結構，即使是在有機合成化學高度發達的今天，通過化學全合成來獲得產品也是一項艱巨的挑戰。直到2004年才首次報道了硫鏈絲菌素A的化學合成[Angew?Chem?Int?Ed?Engl.2003?Jul?28；42(29)：3418-24]，整個合成過程操作繁瑣，產率低下。通過化學合成所獲得的結構類似物即使在活性和水溶性方面的性質得到改善，也可能因為合成的復雜性而使實際生產成本過高。

我們以微生物來源的硫鏈絲菌素為目標分子，從克隆生物合成基因簇出發，采用微生物學、分子生物學、生物化學及有機化學相結合的方法研究其生物合成，通過對其生物合成機制的研究揭示了其經由核糖體合成的生物合成機制，并揭示了包括喹萘啶酸在內的獨特化學結構形成的酶學機理，在此基礎上運用代謝工程的原理，合理修飾硫鏈絲菌素的生物合成途徑，探索水溶性好、生物利用度高、活性更好、并能通過微生物發酵大量生產的新型藥物。

發明內容：

本發明涉及一種由鏈霉菌Streptomyces?laurentii?ATCC31255產生的具有抗革蘭氏陽性菌活性的抗生素——硫鏈絲菌素(Thiostrepton)的生物合成基因簇的克隆、測序、分析、功能研究及其應用。

本發明中整個基因簇共包含22個基因的核苷酸序列或互補序列(序列1)，其中一個基因(TsrH)負責編碼硫鏈絲菌素的前體肽，九個基因(tsrO、tsrM、tsrJ、tsrK、tsrS、tsrL、tsrI、tsrC、tsrR)負責對tsrH編碼的前體肽進行后修飾，形成整個大環骨架；七個基因(tsrF、tsrA、tsrE、tsrB、tsrD、tsrU、tsrP)負責以色氨酸為前體，合成喹萘啶酸結構單元；一個基因tsrQ負責對形成的喹萘啶酸進行活化，在其他酶的催化作用下連接到大環骨架上，并最終形成分子中的第二個大環。

本發明還提供了一個編碼氨基轉移酶的核苷酸序列，由序列2中的氨基酸序列組成，命名為tsrA，其基因的核苷酸序列位于序列1中第3774-2686堿基處。

本發明還提供了一個脂肪水解酶的核苷酸序列，由序列3中的氨基酸序列組成，命名為tsrB，其基因的核苷酸序列位于序列1中第4626-3796堿基處。

本發明還提供了一個編碼天門冬酰胺合成酶的核苷酸序列，由序列4中的氨基酸序列組成，命名為tsrC，其基因的核苷酸序列位于序列1中第6541-4685堿基處。