[發明專利]直接的mRNA富集定量方法

無效

• 申請號: 200810202302.1
• 申請日: 2008-11-06
• 公開（公告）號: CN101392295A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發明（設計）人: 董德賢;任慧娟;朱紅亮;許煜泉;李榮秀
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種生物工程技術領域的方法，具體是一種直接的mRNA富集定量方法。

背景技術

RNA在生物遺傳信息的傳遞上起著重要作用。目前，有許多基于首先進行RNA抽提，然后間接進行mRNA定量方法，例如：northern印跡、實時定量RT-PCR檢測和DNA芯片等。在現有常規方案中，雖然northern印跡分析可用于量化多目標基因，但是其靈敏度較低，雜交需要大量的總RNA且檢測周期長。

經對現有技術的文獻檢索發現，經典的mRNA定量法是實時定量RT-PCR(Bustin等：Quantitative?real-time?RT-PCR--a?perspective，Journal?ofMolecular?Endocrinology(分子內分泌學雜志)2005年34卷597-601頁)。該法的特征在于：先提取RNA，然后將mRNA反轉錄成cDNA，再PCR擴增定量。需要至少1個小時的反轉錄及兩個小時PCR擴增，總檢測時間太長；存在反轉錄酶非線性轉錄，Taq酶非線性放大的傾向，RNA模板易降解，很難自動化等難題。微陣列芯片技術，可同時進行數以千計的基因表達水平的分析，但是由于雜交條件非特異而靈敏度相對較低。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種直接的mRNA富集定量方法，不需要進行RNA抽提，快速簡便，易于自動化，特異性強，在常規的實驗條件下即可完成對RNA的定量檢測，可以迅速直接地監測的mRNA水平的變化。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明不需要進行RNA抽提，在待檢測的菌體或組織破碎后，利用特異性的核酸探針液相雜交保護特異性的mRNA部分片段后，用S1和RNAse酶切除去單鏈DNA，未保護的RNA，過量的探針和錯配的雜交體，完全配對的mRNA片段經生物素-鏈親和素交互作用被磁珠富集后，用雙鏈結合染料直接線性放大定量。

本發明包括如下步驟：

第一步，探針設計：利用待檢測的mRNA序列設計和合成互補的DNA或RNA探針，5’端或3’端用生物素標記；

所指的待檢測的mRNA包括各種生物體基因經轉錄產生的核酸產物，包括tRNA，microRNA或sRNA等。

第二步，保護雜交：待檢測的菌體或組織樣品在緩沖液中經破碎后，用設計的探針進行雜交，同時保護待檢測的mRNA部分片段。

所述的待檢測的菌體或組織樣品包括細菌、真菌、植物組織、動物組織等。

所述的緩沖液包括各種雜交緩沖液。

第三步，用S1和RNAse酶切除去單鏈DNA、未保護的RNA、過量的探針、錯配的雜交體，留下完全配對的，帶生物素標記的探針和mRNA雜交體。

第四步，用鏈親和素包被的磁珠富集帶生物素標記的探針和mRNA雜交體，同時去除各種細胞碎片、蛋白等雜質。

所述的鏈親和素包被的磁珠是指用鏈親和素經物化處理包被的磁性材料，包括納米磁性材料。

第五步，用雙鏈結合染料直接定量mRNA。

所述的雙鏈結合染料包括各種能與RNA/RNA，DNA/RNA雜交體結合或附著的染料。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：1)可以迅速直接地監測的mRNA水平的變化，不需要進行RNA抽提；2)結果穩定，可重復性好。避免了RNA降解，非線性反轉錄，非線性PCR擴增帶來的偏差。3)方法簡單，易于自動化。

本發明實施例所使用的熒光假單胞菌M18，已在中國專利局指定的保藏單位：北京，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號：CGMCCNO.0462，保藏時間：2000.6.27。

附圖說明

圖1為本發明方法的流程圖。

具體實施方式

下面對本發明的實施例作詳細說明：本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。

如以下實施例按照如圖1所示的流程進行實施。

實施例1?定量phzC基因的mRNA水平

第一步，根據GenBank中phzC基因序列(EF491207)，用Oligo?6.0設計特異性DNA探針。探針序列為：5’-biotin-GACAGCTCGTAGTCGAGCAGCAGCATCTCGTGGCTGGTCCAGACCGGCGAGGCATTCGC。5’端用生物素標記。利用Pseudomonas?aeruginosa?PA01(AE004091)的基因組序列進行BLAST分析其特異性。