[發明專利]基于基因置換技術的活菌內標的制備方法

有效

• 申請號: 200810202295.5
• 申請日: 2008-11-06
• 公開（公告）號: CN101397587A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發明（設計）人: 史賢明;龍飛;施春雷;朱欣娜;張忠明
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種生物技術領域的方法，具體地說是一種可廣泛運用于熒光定量的基于基因置換技術的活菌內標的制備方法。

背景技術

熒光定量PCR(real-time?quantitative?polymerase?chain?reaction的縮寫)，是指：熒光定量聚合酶鏈式反應。熒光定量PCR技術是在普通PCR技術基礎上發展起來的一種核酸定量技術，它是在普通的PCR系統中加人一種與目標片段序列互補的雙標記熒光探針，該探針的5’端標記熒光報告基團，3’端標記熒光淬滅基團，當探針完整時，由于淬滅基團的作用，報告基團不能產生熒光；在PCR擴增中由于Taq酶的5’-3’外切酶的活性將探針酶切降解，使得熒光報告基團分離，淬滅基團對其淬滅作用解除，報告基團即可發出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈就有一個熒光分子形成，經特定的熒光分析儀測定相應的熒光強度，能夠對PCR擴增的每一循環進行觀察，然后與所建立的標準曲線進行比較，即可推算出目標片段的起始量。熒光定量PCR技術與以前的以終點法進行定量的普通PCR技術相比具有很大的優勢。首先，它不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的靈敏性、重復性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴增并進行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進行染膠、照膠等操作。目前它作為一個極有效的實驗技術，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。但是熒光定量PCR方法在不同的實驗室或檢測部門所檢測的目的基因和操作流程有一定的差異，沒有形成統一標準，得到的檢測結果也不盡相同。近年來的研究表明，增菌培養過程中抑制目標菌生長的成分、目標菌的收集效率和DNA提取過程目標菌的損失及殘留的PCR抑制成分都會影響熒光定量PCR的最終檢測結果，導致假陰性現象的發生。盡管熒光定量PCR方法在不斷的改進和完善，卻不能有效地阻止試驗過程中假陰性結果的發生。為了解決熒光定量PCR方法中普遍存在的假陰性問題，近幾年在熒光定量PCR擴增體系中引入了擴增內標。其主要原理是：在熒光定量PCR中使用與目的基因相似的擴增內標，它的兩端引物結合序列與目的基因完全一致，但具有不同的探針結合序列，使之不能與目的基因的探針結合，只能與內標探針結合。于是，在含內標的熒光定量PCR體系中有兩種DNA模板——目的基因片段和擴增內標；一對引物，該對引物既能與目標基因片段結合，也與擴增內標結合；兩條探針——目標基因探針和擴增內標探針，分別結合目標基因片段和擴增內標。在擴增內標與目標片斷的共同擴增中如果存在抑制現象，擴增內標的PCR擴增也將被抑制，從而達到指示PCR反應假陰性的目的。

制備IAC(擴增內標)的方法有很多，根據不同的實驗目的和要求采用不同的制備方法。一般采用分子克隆技術，將一段人工構建的序列插入到質粒中。這段人工序列是利用克隆技術將目標序列的PCR產物通過插入、刪除或者替換等手段處理后制備的。由于目前的擴增內標均是構建在質粒上然后直接添加到PCR反應體系中，無法象普通細菌一樣添加到增菌培養液中與目標菌一起經歷增菌培養、菌體收集、DNA提取及PCR擴增全過程，因此僅僅只能指示PCR擴增過程中的抑制成分，而無法監測增菌培養過程中影響目標菌生長的抑制因子、目標菌的收集效率和DNA提取過程中的目標菌損失率，這些都將在很大程度上影響最終的PCR檢測結果，從而大大限制了它的廣泛應用和相應技術標準化的進程。

經對現有技術的文獻檢索中發現，基因置換技術的出現和完善使得外源基因片段整合到細菌染色體上，如：Thomason?L，Court?DL.Recombineering：geneticengineering?in?bacteria?using?homologous?recombination.Curr?Protoc?MolBiol.2007?Chapter?1：Unit?1.16(Thomason?L，Court?DL，同源重組技術在細菌基因工程中的應用。分子生物學試驗手冊，2007第一章：第1.16節)。這使得內標序列不僅可以構建在質粒上還可以通過基因置換技術插入到細菌染色體中，成為帶有內標序列的活菌內標，該活菌內標可以和目標菌一起共同經歷增菌培養、菌體收集、DNA提取和PCR擴增的全過程。到目前為止還沒有關于活菌內標運用于微生物PCR檢測的報道。

發明內容