[發明專利]基于基因置換技術的活菌內標的制備方法

有效

• 申請號: 200810202295.5
• 申請日: 2008-11-06
• 公開（公告）號: CN101397587A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發明（設計）人: 史賢明;龍飛;施春雷;朱欣娜;張忠明
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1.一種基于基因置換技術的活菌內標的制備方法，其特征在于，包括步驟如下：

(1)上下游在基因置換過程中與單核細胞增生李斯特菌hly目標基因發生雙交換DNA的同源重組序列、擴增內標序列和卡那霉素抗性基因序列的選擇和相應酶切位點的設計；

(2)含上下游同源序列、內標序列和卡那霉素抗性基因的同源重組質粒pKSV7-UIKD的制備；

所述的上游同源序列，如Seq?ID?No.1所示；

所述的下游同源序列，如Seq?ID?No.2所示；

所述的擴增內標序列，如Seq?ID?No.3所示；

(3)同源重組質粒的電轉化感受態單核細胞增生李斯特菌及相應電轉化后出現了供體性狀的受體細胞轉化子的篩選；

(4)發生基因置換的單核細胞增生李斯特活菌內標的篩選；

(5)通過在待檢測樣品中添加活菌內標與目標菌共同經歷增菌培養、菌體收集、DNA提取和PCR擴增來驗證所制備的擴增內標。

2.根據權利要求1所述的基于基因置換技術的活菌內標的制備方法，其特征是，所述的同源重組質粒，是指：包含上下游同源序列、內標序列和卡那霉素抗性基因序列的溫敏型質粒，當溫度高于37℃時該質粒不能在宿主菌中復制，從而介導基因置換現象的發生。

3.根據權利要求1所述的基于基因置換技術的活菌內標的制備方法，其特征是，所述的擴增內標序列是人工設計的，具有與目標擴增序列相同的長度和GC含量，在確保與目標片斷擴增效率一致性的同時與其它致病微生物基因組序列非同源。

4.根據權利要求1所述的基于基因置換技術的活菌內標的制備方法，其特征是，所述的感受態單核細胞增生李斯特菌，是指：單核細胞增生李斯特菌細胞經過一些特殊方法的處理后，細胞膜的通透性發生變化，從而能夠容納許多包含外源DNA的載體分子通過的生理狀態。

5.根據權利要求1所述的基于基因置換技術的活菌內標的制備方法，其特征是，所述的電轉化，是指：利用瞬間高壓在感受態細胞上打孔，從而便于外源片段從孔洞中進入到細胞內的技術。

6.根據權利要求1所述的基于基因置換技術的活菌內標的制備方法，其特征是，所述的活菌內標，是指：通過基因置換技術人工設計制備的含有擴增內標序列的突變菌株，具有與目標菌相似的生長速度、菌體收集效率、DNA提取效率及PCR擴增效率。

7.根據權利要求1所述的基于基因置換技術的活菌內標的制備方法，其特征是，所述的步驟4中的篩選，是指：在41℃和氯霉素存在的條件下連續傳代含同源重組質粒的單核細胞增生李斯特菌轉化子，涂氯霉素抗性平板挑選發生單交換的菌株；在30℃和不含抗生素的條件下連續傳代挑選的單交換菌株，涂無抗平板，再將無抗平板上的菌落轉接到卡那霉素抗性平板和氯霉素抗性平板，挑選卡那霉素抗性平板上長，氯霉素抗性平板上不長的疑似發生基因置換的菌落并進行PCR驗證。