[發(fā)明專利]ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810201933.1
• 申請日: 2008-10-30
• 公開（公告）號: CN101386650A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發(fā)明（設計）人: 張延;邵棟
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C12N15/54;C12N15/70;C12N9/10
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1、一種ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、對ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T17的蛋白質序列進行比對，確定抗原序列shortT18；

步驟二、根據(jù)抗原序列和質粒多克隆位點設計引物，從ppGalNAc-T18全長基因PCR產物中得到目的片段；目的片段經Sal?I、Not?I雙酶切，割膠回收，用連接酶連接入經Sal?I、Not?I雙酶切的pGEX-5X-1空載體，構成pGEX-5X-1-shortT18原核表達載體并轉化大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)；挑單菌落，抽提質粒，測序；

步驟三、將重組表達質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中；

步驟四、培養(yǎng)轉化重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)；

步驟五、誘導培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)；

步驟六、收集誘導后的菌體，用緩沖液振蕩混勻，超聲波破碎，離心并收集上清；

步驟七、純化得到的蛋白上清；

步驟八、用純化的蛋白對家兔進行進行免疫，取血，離心得到抗血清；

步驟九、純化抗血清，得到ppGalNAc-T18抗體。

2.根據(jù)權利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是，步驟一中，所述的抗原序列shortT18的氨基酸序列為：

RGQEPAPDKKLEEDKGDTLKIIERL

DHLENVIKQHIQEAPAKPEEAEAEPFTDSSLFAHWGQELSPEGRRVALKQFQY。

3.根據(jù)權利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是，步驟二中，所述的引物序列為：

上游引物為，5’-CAGCGGTCGACTCCGGGGGCAGGAGCCG-3’；

下游引物為，5’-GGCATGCGGCCGCTCGTACTG?GAATTGCTT-3’。

4.根據(jù)權利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是，步驟二中，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)中氨芐青霉素使用濃度為100μg/ml，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為12h。

5.根據(jù)權利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是，步驟四中，所述大腸桿菌BL21(DE3)的OD值為0.8-1.2；大腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)基溶液組分及質量分數(shù)分別為:蛋白胨1.6％，酵母提取物1％，NaCl?0.5％；培養(yǎng)溫度為37℃。

6.根據(jù)權利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是，步驟五中，所述的誘導具體為：加入IPTG?0.1mM-0.5mM，誘導溫度為26℃，誘導時間為3h-5h。

7.根據(jù)權利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是，步驟六中，菌體振蕩所用的緩沖液組分為：pH值為7.3的PBS，體積分數(shù)為1％的Triton?X-100，1mM的PMSF。

8.根據(jù)權利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是，步驟七中，所述純化具體步驟為：使用GE?Healthcare公司的GSTrapHP蛋白純化柱，先用5倍柱體積的PBS平衡該柱，接著讓蛋白上清通過該柱，再用5倍柱體積的PBS沖洗該柱，然后用5倍柱體積的還原性谷胱甘肽溶液洗脫，還原性谷胱甘肽溶液的組分為：50mM?Tris-HCl，10mM還原性谷胱甘肽，pH值為8.0，然后UV檢測，收集洗脫峰。

9.根據(jù)權利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是，步驟八中，所述的取血是在對家兔免疫后第3個月時進行。

10.根據(jù)權利要求1所述的ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其特征是，步驟九中，所述純化的具體步驟為：使用GE?Healthcare公司的HitrapProtein?A?HP抗體純化柱，先用10倍柱體積的結合液平衡該柱，結合液成分為20mM?Na₃PO₄，其pH值為7.0，接著讓ppGalNAc-T18抗血清通過該柱，再用5倍柱體積的結合液沖洗該柱，然后用5倍柱體積的洗脫液洗脫，洗脫液成分為0.1MNa₃C₆H₅O₇，pH值為3.0-6.0，UV檢測，收集洗脫峰。