[發明專利]ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法

無效

• 申請號: 200810201933.1
• 申請日: 2008-10-30
• 公開（公告）號: CN101386650A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 張延;邵棟
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C12N15/54;C12N15/70;C12N9/10
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種生物技術領域的制備方法，具體涉及一種ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法。

背景技術

UDP-半乳糖酰胺：多肽N-乙酰氨基半乳糖轉移酶(ppGalNAc-T)是O-型糖蛋白糖鏈合成反應的第一步起始糖基轉移酶，它能將N-乙酰氨基半乳糖結合到蛋白質肽鏈的絲氨酸或蘇氨酸上。人體中的ppGalNAc-T為一家族酶，迄今為止，己有16個成員被研究報道，它們在人體組織中的分布和在體外多肽糖基化修飾的底物專一性上都存在著差異。ppGalNAc-T可以作為腫瘤標志物，已經發現在神經母細胞瘤衍生細胞株中有著特異性高表達的ppGalNAc-T13，它可以作為脊髓發生神經母細胞瘤早期診斷標志。另外，ppGalNAc-T6可以作為乳腺癌的免疫組織化學檢測標志。最新研究發現ppGalNAc-T14調控死亡受體Apo2L/TRAIL的糖基化修飾，ppGalNAc-T14的過表達能顯著促進細胞的凋亡。ppGalNAc-T在具有糖基轉移酶功能之外還潛在有重要的臨床意義。現在，針對ppGalNAc-T參與的O-糖基化研究已成為國內外研究的熱點。獲得各種ppGalNAc-T的抗體，對精確定位ppGalNAc-T在組織和細胞中的分布有著重要作用，從而更真實的反映它的生物學功能。然而ppGalNAc-T家族蛋白的同源性極高，不同編號的ppGaNTaseT之間的同源性可達到40％～60％，因此保證ppGalNAc-T抗體的特異性至關重要。

ppGalNAc-T家族蛋白為II型膜蛋白，有一個4～22個氨基酸的N端處于胞質中，繼以一個15～25個氨基酸的穿膜錨定結構域，通過一個長短不一的莖部與C端伸入高爾基體管腔內大約450個氨基酸的催化區相連接。ppGalNAc-T18從蛋白質一級結構分析上屬于UDP-半乳糖酰胺：多肽N-乙酰氨基半乳糖轉移酶家族基因，它與ppGalNac-T17在氨基酸序列水平上具有54％的高結構相似性，雖然在組織和細胞中檢測到ppGalNAc-T18mRNA的存在，但是目前為止還沒有檢測到它作為ppGalNAc-T的糖基轉移酶活性，ppGalNAc-T18作為一個UDP-半乳糖酰胺：多肽N-乙酰氨基半乳糖轉移酶結構類似基因在細胞或者組織中到底發揮什么功能是本領域需要解決的一項技術難題。

經對現有技術的文獻檢索發現，有科研人員對ppGalNAc-T13抗體的制備采用了合成多肽的方法(N?Berois?et?al.，ppGalNAc-T13：A?New?Molecular?Marker?of?BoneMarrow?Involvement?in?Neuroblastoma，Clinical?Chemistry，2006，52：1701-1712)。該方法一般需要合成15個左右的氨基酸，它比較容易保證抗體的特異性。但是，多肽的分子量相對較小，免疫原性較差，得到抗體比較困難。為此，通常用MAP或者KLH與多肽偶聯，但這樣成本很高，一般用來制備抗原的多肽要求10mg-20mg，純度要求85％以上，這種級別的多肽合成價格為120元每個氨基酸，修飾基團MAP的價格也在1000元以上。較低的免疫原性和高昂的成本，限制了合成多肽方法的應用。目前尚未見與ppGalNAc-T18抗體制備有關的報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提出一種ppGalNAc-T18的特異性多克隆抗體的制備方法。在ppGalNAc-T18中選擇一段氨基酸，將其原核表達，用獲得的抗原免疫家兔，制備得到抗體。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明涉及的一種ppGalNAc-T18特異性多克隆抗體的制備方法，其步驟具體為：

步驟一、對ppGalNAc-T18和ppGalNAc-T17的蛋白質序列進行比對，確定抗原序列shortT18；

步驟二、根據抗原序列和質粒多克隆位點設計引物，從ppGalNAc-T18全長基因PCR產物中得到目的片段；目的片段經Sal?I、Not?I雙酶切，割膠回收，用連接酶連接入經Sal?I、Not?I雙酶切的pGEX-5X-1空載體，構成pGEX-5X-1-shortT18原核表達載體并轉化大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素篩選培養；挑單菌落，抽提質粒，測序；

步驟三、將重組表達質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中；

步驟四、培養轉化重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)；

步驟五、誘導培養的大腸桿菌BL21(DE3)；

步驟六、收集誘導后的菌體，用緩沖液振蕩混勻，超聲波破碎，離心并收集上清；