[發明專利]一種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術

無效

• 申請號: 200810201650.7
• 申請日: 2008-10-23
• 公開（公告）號: CN101760561A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 何劍軍;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海復星醫藥(集團)股份有限公司;上海復星醫學科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術，可在非常短的時間內完成臨床標本中EV71病毒含量的測定，屬于分子生物學領域。

背景技術

腸道病毒71型(enterovirus?71，EV71)是小RNA病毒科腸道病毒屬成員。1969年首次從美國加利福尼亞患有中樞神經系統疾病的嬰兒的糞便標本中分離到EV71病毒此后，EV71病毒的流行范圍遍及全球。據報道，EV71在世界范圍內已引起十多次大的爆發與流行。目前，人類是EV71病毒唯一已知的自然宿主，病毒主要通過人群間的密切接觸傳播，病毒經過被感染者的口鼻分泌物、糞便和飛沫等傳播。近年來，EV71病毒的流行在亞太地區呈上升趨勢，2008年在中國大陸爆發的手足口病(hand-foot-and-mouth?disease，HFMD)便是因EV71病毒引起的。中國大陸EV71的分子流行病學資料還不完整，EV71的采樣標本主要來源于手足口病患者。中國大陸已報道的10例病毒株均為C基因型。

目前診斷方法包括：

(一)病毒分離和培養

常使用RD細胞(來源于人橫紋肌肉瘤細胞)來進行病毒培養，得到初步結果需要至少一周的時間。

從HFMD患兒的腦脊液、血液、皰疹液等臨床標本中分離出病毒有診斷價值，但單從咽拭子或糞便中分離到病毒不能確診。從有上述臨床癥狀群患者的咽拭子或糞便中重復分離到同一型病毒，且從周圍患同樣疾病者中也檢出相同的病毒，且病毒分離率遠高于正常人群，則有診斷的參考價值。

(二)測定人雙份血清標本的中和抗體滴度

對于HFMD的雙份血清中和實驗結果來說，如果恢復期血清較急性期血清EV71或CA16中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關實驗證實；如果單份血清中和抗體滴度大于1∶256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1∶128判定為可疑陽性。

(三)逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

或通過電泳進行檢測，或通過熒光進行檢測，但因使用兩步RT-PCR，操作較為復雜，而且需要的時間比較長(通常完成全部檢測需要3個小時)，電泳的方法容易導致污染。

發明內容

本發明的目的是提供一種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術，用于快速、簡便的檢測標本中EV71病毒的含量。

1.為達到上述目的，本發明采用的技術方案是：將EV71病毒C基因型序列和coxsackievirus?A16(CA16)病毒等其他腸道病毒序列進行比對，選擇EV71病毒的特異、保守區設計多套PCR檢測引物和探針，通過篩選來確定最佳的方案，最終確定為如下序列。

引物1：5`-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3`????(Seq?No.1)

引物2：5`-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3`??(Seq?No.2)

探針1：5`-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-3`(Seq?No.3)

或者與上述序列同源性大于75％的序列、或者上述所有序列的堿基互補序列。

其中標記探針的熒光發光基團可以為FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine?Red、Rhodamine?Green、Rhodamine?6G、Oregon?Green?488、Oregon?Green?500、Oregon?Green?514、Texas?Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine?orange或ROX中任意一種；3`端熒光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基團中的任意一種。

2.考慮到陽性臨床標本的獲取受到國家法規的管制，設計合成人工RNA序列用于標準品或陽性對照品等的制備。序列如下：

AGAGAUAGCCCUCCCUCUUGAAGGCACACCUAACCCAAAUGGUUAUGCUAACUGGGAUAUAGAUAUAACGGGUUACGCGCAAAUGCGUAGAAAGGUGGAGCUAUUCACCGACAUGCGCUU(120bp)(Seq?No.4)