[發明專利]一種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術

無效

• 申請號: 200810201650.7
• 申請日: 2008-10-23
• 公開（公告）號: CN101760561A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 何劍軍;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海復星醫藥(集團)股份有限公司;上海復星醫學科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術，其特征在于包含一對引物和一條探針，擴增目標片段長度為120bp，引物和探針序列為：

引物1：5`-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3`(Seq?No.1)

引物2：5`-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3`(Seq?No.2)

探針1：5`-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-3`(S?eq?No.3)

或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

2.根據權利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術，其特征在于標記探針5`端的熒光發光基團為可以FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine?Red、Rhodamine?Green、Rhodamine?6G、Oregon?Green?488、Oregon?Green?500、Oregon?Green?514、Texas?Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine?orange或ROX中任意一種；3`端熒光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基團中的任意一種。

3.根據權利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術，其特征在于使用一步法RT-PCR熒光檢測技術，能快速、準確的對臨床標本中的EV71病毒含量進行定性或定量分析。

4.根據權利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術，其特征在于，使用人工合成的RNA序列作為RNA陽性對照品，序列如下：(Seq?No.4)AGAGAUAGCCCUCCCUCUUGAAGGCACACCUAACCCAAAUGGUUAUGCUAACUGGGAUAUAGAUAUAACGGGUUACGCGCAAAUGCGUAGAAAGGUGGAGCUAUUCACCGACAUGCGCUU(120bp)將此人工合成序列稀釋至適當濃度梯度，作為EV71病毒RNA的標準品。

5.根據權利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術，其特征在于，RT-PCR反應組分包括：10mM?Tris-HCl(PH?8.3)、50mM?KCl、300uM?dNTP、3mMMgCl₂、200nM引物1、200nM引物2、200nM探針1、0.5U?AMV酶、0.5U?RNaseInhibitor、0.1mg/ml?BSA、5mM?DTT和1.5U?Taq酶，RT-PCR運行程序可以為：先在50℃反應5分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃10秒→60℃35秒循環40次(60℃退火條件下采集熒光信號)。

6.根據權利要求1所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測技術，其特征在于，可制備熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，試劑盒組成包括：

組成成分(20人份/盒)???????????體積

One?step?RT-PCR反應緩沖液?????380μl

混合酶???????????????60μl

RNA標準品????????????120μl

RNA標準品????????????220μl

RNA標準品????????????320μl

RNA標準品????????????420μl

DEPC水???????????????1ml

其中，One?step?PCR反應組分(終濃度)包括：10mM?Tris-HCl(PH?8.3)、50mM?KCl、300uM?dNTP、3mM?MgCl₂、200nM引物1、200nM引物2和200nM探針1。混合酶的組成成份(終濃度)包括：0.5U?AMV酶、0.5U?RNaseInhibitor、0.1mg/ml?BSA、5mM?DTT、1.5U?Taq酶。其中，探針1的5`端標記的發光基團為FAM，在3`端標記的淬滅基團為Eclipse。

7.根據權利要求6所述的EV71病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，操作步驟如下：

PCR反應液的配制：按每人份One?step?RT-PCR反應緩沖液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應液，并按22ul/管分裝到0.2ml?PCR管中，然后加入適量提取好的總RNA并補充DEPC水(RNA標準品直接取8ul)，使反應總體積為30ul，按如下程序進行一步法RT-PCR檢測：反應管先在50℃反應5分鐘，然后95℃保溫5分鐘，再按94℃10秒→60℃35秒循環40次(60℃退火條件下采集FAM通道熒光)。