[發明專利]一種高靈敏度檢測肺炎支原體的靶序列及試劑盒

無效

• 申請號: 200810201637.1
• 申請日: 2008-10-23
• 公開（公告）號: CN101760519A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 沈維祥;吳大治;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海復星醫藥(集團)股份有限公司;上海復星醫學科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/31;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬生物技術領域，特別是涉及一種聚合酶鏈式反應擴增P1細胞粘附蛋白基因(P1?Cytadhesin?Gene)的重復序列，從而高靈敏度特異檢測臨床樣本肺炎支原體的方法，以及利用該方法獲得的實時熒光PCR檢測試劑盒。

背景技術

支原體肺炎是一種非常嚴重的傳染性疾病，在肺炎中，支原體肺炎約占15％～20％，并且導致多種并發癥，支原體肺炎是由肺炎支原體引起的急性肺部感染。肺炎支原體廣泛存在，無地區性差別，平時散發，支原體肺炎每4～5年有1次流行。發病季節不明顯，寒冷季節發病率較高，占住院肺炎的10％～20％，流行期間可占30％。肺炎支原體的感染可發生在不同年齡的小兒，在年長兒多見，在新生兒中報道不多。蔣巍等報道了新生兒感染14例，認為孕婦生殖道支原體感染，經宮內或產道可感染胎兒和新生兒，是引起早產、新生兒低體重、新生兒肺炎和中樞感染的主要原因。肺炎支原體的感染率有逐年增多的趨勢。支原體感染的臨床主要表現為咳嗽、咳痰、哮喘、氣促、胸悶、胸痛及不同程度的發熱和驚厥等。

肺炎支原體感染也可導致一系列呼吸系統外疾病，可引起支原體血癥，直接侵犯各系統、組織引起病變。國外報道，從肺炎支原體呼吸道感染的病例血液中直接分離出肺炎支原體，提示肺炎支原體可進入血液，存在呼吸系統以外的部位增殖的可能性。支原體感染引起的肺外并發癥常累及心血管系統、血液系統、中樞神經系統、皮膚及肝腎器官。國外報道，皮疹發生率為25％，皮疹形態可為紅色斑丘疹、麻疹樣或猩紅熱樣皮疹，也可有水皰、大皰性疹，7％為中樞神經系統損害，以支原體腦炎多見，可并發心肌炎、心包炎甚至心力衰竭，發生率4％-5％，泌尿系統可出現蛋白尿、血尿和腎功能衰竭。發病機制除直接侵襲、毒紊作用外，目前傾向于免疫損傷。

石蕙文等報道支原體肺炎并發一過性單純紅細胞再生障礙性貧血1例，其原因可能與感染直接抑制紅細胞DNA合成或免疫紊亂有關。支原體肺炎造成溶血多為自身免疫性溶血，隨著支原體肺炎的好轉，患兒紅細胞系造血恢復，預后良好。

可見，要消滅肺炎支原體需要多方努力，如發展快速診斷方法、研制新藥、進行分子機制研究和疫苗研究等，其中發展快速診斷方法最為緊迫。目前常用的檢查方法包括：冷凝聚試驗、間接血凝抑制試驗、補體結合試驗、肺炎支原體的培養、聚合酶鏈反應(PCR)。支原體肺炎的診斷有病原體培養、多種特異性血清學檢查，近年又有基因探針及DNA、PCR方法。而冷凝聚試驗、間接血凝抑制試驗、補體結合試驗及肺炎支原體的培養由于特異性差、敏感性低等問題在臨床應用價值受限。冷凝聚試驗、支原體抗體測定時兩者的高峰出現晚，多在2～4周，并與患者年齡、免疫功能、感染輕重、病程的長短有密切關系。肺炎支原體感染后血清冷凝聚抗體陽性者，僅僅占45％～75％。嬰幼兒由于免疫系統發育未完善，部分免疫功能低下，在肺炎支原體感染時抗體產生不足，從而影響檢出率，咽拭培養分離肺炎支原體，對于一些血清學不能診斷肺炎支原體的患兒，可提高檢出陽性率。LISA方法測定特異性MP-IgA，其陽性率達56.01％；用顆粒凝聚法測定的MP-IgM，其陽性率達60.81％。目前國內外一致認為MP-IgM、MP-IgG等特異性抗體測定是臨床診斷肺炎支原體感染較為可靠的指標之一。Granstorm認為，測定MP-IgA抗體比MP-IgM更有價值。其原因是MP-IgM抗體的產生可因漿細胞受非相關抗原(如呼吸道病毒等)刺激后出現非特異反應，而MP-IgA的產生不受這些因素的影響。在MP-IgA陽性的基礎上，MP-IgM的進一步的上升或下降可以提示有無支原體感染的可能。

近年來發展起來的熒光定量PCR(Fluorescence?Quantitative?PCR，FQ-PCR)技術以其靈敏度高，特異性好，速度快等優點在基因表達水平分析、病原體的定性檢測和定量檢測等方面得到廣泛應用，并且已經成為當前病毒核酸定量的主要方法。