[發(fā)明專利]玉米彎孢菌萌發(fā)分生孢子遺傳轉(zhuǎn)化的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810201630.X
• 申請日: 2008-10-23
• 公開（公告）號: CN101381682A
• 公開（公告）日: 2009-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳捷;劉銅;劉力行;姜雪
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 上海交達專利事務(wù)所
• 代理人: 毛翠瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種玉米彎孢菌萌發(fā)分生孢子遺傳轉(zhuǎn)化的方法，具體涉及一種通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的，以玻片懸浮法培養(yǎng)出的萌發(fā)分生孢子為材料進行遺傳轉(zhuǎn)化而獲得玉米彎孢菌突變體的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

玉米彎孢菌葉斑病是由玉米彎孢菌(Curvularia?lunata(Wakker)Boed)引起的，在世界的大部分國家造成過重大危害。1996年，該病在中國造成嚴(yán)重的玉米損失，40％玉米產(chǎn)區(qū)被該病侵染。為了更好的防治該病和選育抗病品種，對該病菌的致病分子機理進行深入研究具有重要意義。分離和鑒定彎孢菌的致病相關(guān)基因，是達到這一目標(biāo)的關(guān)鍵所在，而創(chuàng)造致病缺陷性突變體則是分離和鑒定致病相關(guān)基因的一種有效途徑之一。目前獲得絲狀真菌突變體有很多方法，例如質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化、電激轉(zhuǎn)化、基因槍、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(REMI)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化，自然生物技術(shù)，1998)。但質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化、電激轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(REMI)、基因槍法方案中要使用原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化或原生質(zhì)體結(jié)合氯化鈣和聚乙二醇(PEG)，轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化效率較低，其轉(zhuǎn)化效率低使得真菌遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)展緩慢。近來年的研究表明利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化比這些方法有許多優(yōu)點。該方法具有易于操作、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定、插入位點無序列特異性和轉(zhuǎn)化受體多樣性等優(yōu)點，這些優(yōu)點使農(nóng)桿菌介導(dǎo)的突變技術(shù)成為絲狀真菌插入突變的重要工具。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系可以利用各種形式的受體，如原生質(zhì)體、分生抱子、菌絲體等，但有時并不是所有的受體都能用于轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化米根霉Rhizopus?oryzae和卷枝毛霉Mucor?circinelloides時只能用原生質(zhì)體作為受體。在轉(zhuǎn)化盾殼霉Coniothyrium?minitans和晚疫病菌Phytophthora?infestans時則用萌發(fā)的孢子最理想，因此在轉(zhuǎn)化某些真菌時可能只能利用萌發(fā)孢子的才能轉(zhuǎn)化。制備轉(zhuǎn)化的萌發(fā)孢子是用分生孢子涂布在玻璃紙或纖維素膜，萌發(fā)幾天后用生理鹽水洗下。由于這時萌發(fā)孢子的芽管附著在膜孔上，要從膜上洗下萌發(fā)孢子在操作中比較困難，同時洗下的孢子液中混有較多其它雜質(zhì)，其雜質(zhì)不易除掉，使轉(zhuǎn)化效率低，重復(fù)性差。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種玉米彎孢菌萌發(fā)分生孢子遺傳轉(zhuǎn)化的方法，操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好，獲得的轉(zhuǎn)化子可為篩選弱致病性和致病缺陷性突變體提供豐富的篩選菌源。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以載玻片和彎孢菌分生孢子為材料，把玉米彎孢菌分生孢子懸浮液滴置于無菌潔凈的載玻片上，然后在保濕的環(huán)境中培養(yǎng)使玉米彎孢菌分生孢子萌發(fā)，萌發(fā)后的玉米彎孢菌分生孢子用生理鹽水洗下后直接做為遺傳轉(zhuǎn)化的受體用于農(nóng)桿菌感染。感染后的萌發(fā)分生孢子經(jīng)共培養(yǎng)、抑菌培養(yǎng)和連續(xù)2代的抗選擇劑篩選培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化子，從而建立了彎孢病菌高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

本發(fā)明的方法具體包括以下步驟：

1、玉米彎孢菌萌發(fā)分生孢子的制備

在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基上將玉米彎孢菌培養(yǎng)5-7天后，用生理鹽水將玉米彎孢菌的分生孢子刮下后用無菌擦鏡紙過濾除去菌絲，得到的玉米彎孢菌分生孢子濾液用0.9％生理鹽水調(diào)整到濃度為10⁵-10⁸孢子/毫升；取有一層保水濾紙培養(yǎng)皿，加無菌水使濾紙濕潤并在表面形成水膜，上加兩根木棒，然后取濃度為10⁵-10⁸孢子/毫升的玉米彎孢菌分生孢子懸浮液100-200μL滴置于無菌潔凈的載玻片中央，分開滴成3-4滴，然后迅速將載玻片倒置，把它兩端隔放在培養(yǎng)皿中兩根木棒上，25-30℃下在黑暗中培養(yǎng)3-9小時；萌發(fā)后的玉米彎孢菌分生孢子用生理鹽水洗下，經(jīng)2000-5000rpm離心5分鐘，用生理鹽水再次調(diào)節(jié)玉米彎孢菌萌發(fā)分生孢子濃度為10⁵-10⁸萌發(fā)孢子/毫升，獲得玉米彎孢菌萌發(fā)分生孢子懸浮液備用；上述一切操作在無菌的條件下進行。

2、載體的準(zhǔn)備