[發明專利]玉米彎孢菌萌發分生孢子遺傳轉化的方法

無效

• 申請號: 200810201630.X
• 申請日: 2008-10-23
• 公開（公告）號: CN101381682A
• 公開（公告）日: 2009-03-11
• 發明（設計）人: 陳捷;劉銅;劉力行;姜雪
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 毛翠瑩

1、一種玉米彎孢菌萌發分生孢子遺傳轉化的方法，其特征在于包括如下步驟：

1)玉米彎孢菌萌發分生孢子的制備：在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上將玉米彎孢菌培養5-7天后，用生理鹽水將玉米彎孢菌的分生孢子刮下后用無菌擦鏡紙過濾除去菌絲，得到的玉米彎孢菌分生孢子濾液用0.9％生理鹽水調整到濃度為10⁵-10⁸孢子/毫升；取有一層保水濾紙培養皿，加無菌水使濾紙濕潤并在表面形成水膜，上加兩根木棒，然后取濃度為10⁵-10⁸孢子/毫升的玉米彎孢菌分生孢子懸浮液100-200μL滴置于無菌潔凈的載玻片中央，分開滴成3-4滴，然后迅速將載玻片倒置，把它兩端隔放在培養皿中兩根木棒上，25-30℃下在黑暗中培養3-9小時；萌發后的玉米彎孢菌分生孢子用生理鹽水洗下，經2000-5000rpm離心5分鐘，用生理鹽水再次調節玉米彎孢菌萌發分生孢子濃度為10⁵-10⁸萌發孢子/毫升，獲得玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液備用；上述一切操作在無菌的條件下進行；

2)載體的準備：取含有雙元載體的農桿菌株AGL-1接到含有100微克/毫升潮霉素的5毫升LB液體培養基中，28℃下震蕩培養至對數生長期，得到OD₆₆₀＝0.6的農桿菌菌液；然后取農桿菌菌液250-400μ加到新鮮的5毫升LB液體培養基中，28℃下震蕩培養過夜至對數生長期，然后在液體IM培養基上誘導培養4-6小時，將農桿菌菌液濃度調至OD₆₆₀＝0.15-0.2備用；其中，所述液體IM培養基的組分為10mM?K₂HPO₄，10mM?KH₂PO₄，2.5mM?NaCl，2mM?MgSO4，0.7mMCaCl₂，9mM?FeSO₄.7H₂O，4mM(NH₄)SO₄，10mM?glucose，40mM2-[N-morpholinoethanesulfonic?acid，pH5.3，100—200μM?acetosyringone，0.5wt％glycerol；

3)轉化：取誘導后的農桿菌菌液與玉米彎孢菌萌發分生孢子懸浮液等體積混合后，涂布于IM固體培養基的玻璃紙上，在黑暗下22-28℃培養24-72小時，然后將IM固體培養基上的玻璃紙轉移到含有200微克/毫升的頭孢霉素和250微克/毫升潮霉素的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂平板培養基上篩選轉化子；將平板培養基在22-28℃下培養5-7天，將能夠抗潮霉素的玉米彎孢菌菌落轉移到預先倒好的含有250毫克/毫升潮霉素的固體馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基上進行二次篩選，第二次篩選得到抗潮霉素的玉米彎孢菌菌落即為轉化子；其中，所述IM固體培養基由每升IM液體培養基加15-18克瓊脂構成。