[發明專利]一種莢膜多糖純化方法

有效

• 申請號: 200810201522.2
• 申請日: 2008-10-22
• 公開（公告）號: CN101724085A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 朱為;江元翔;榮家康
• 申請（專利權）人: 上海生物制品研究所
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A61K39/095;A61K31/715;A61P31/04
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 徐迅

技術領域

本發明涉及疫苗領域，尤其涉及有莢膜細菌的莢膜多糖的處理方法。

背景技術

本領域熟知對于致病菌感染可以采用疫苗來進行預防。目前，常用于預防致病菌感染的疫苗包括：菌體疫苗和亞單位疫苗。菌體疫苗可以通過滅活細菌或對致病菌進行減毒來制備，而亞單位疫苗則通過提取致病菌的蛋白質和/或多糖來制備。

多糖疫苗是通過純化細菌的多糖(例如莢膜多糖)而制備的一類疫苗。已經上市使用的多糖疫苗包括：b型流感桿菌多糖疫苗、腦膜炎球菌多糖疫苗、肺炎球菌多糖疫苗和傷寒Vi多糖疫苗等。

然而，多糖疫苗對2歲以上兒童、少年、青年和成人有效，但對2歲以下幼兒效果不佳，有的還能導致免疫抑制等不良效果。將多糖偶聯到蛋白質上構成多糖-蛋白結合疫苗可以改善多糖疫苗在2歲以下幼兒中的免疫原性，為這些高危易感人群提供保護。

第一個成功的多糖結合疫苗是b型流感桿菌結合疫苗，隨后又研制成功腦膜炎球菌結合疫苗和肺炎球菌結合疫苗。可以直接用純化的多糖經過修飾或未經修飾與經過修飾或未經修飾的蛋白質通過化學鍵偶聯，也可以在偶聯前將純化的多糖經過適當降解處理。

不論是制備多糖疫苗還是多糖結合疫苗，首要的步驟就是從細菌培養物中提取多糖。通常高分子量、具有免疫原性的細菌多糖可用于制備多糖疫苗。

現有技術中公開了從細菌中提取多糖的方法，例如Gotshlich在US3636192中描述了一般的多糖提取方法。

通常，用培養罐培養細菌，從全培養物或經過離心除去菌體的上清液中提制多糖。先用陽離子去污劑沉淀多糖，離心收集沉淀物；用氯化鈣解離后，加入乙醇沉淀核酸等雜質；離心收集上清液，再用乙醇沉淀出粗多糖。用醋酸鈉溶解所得粗多糖，再用苯酚進行抽提，去除蛋白質等雜質。經過離心分離水相和有機相，用乙醇將多糖從水相中沉淀出來，經過無水乙醇、丙酮洗滌并干燥，最終制得精制多糖。在提取過程中也可以采用超速離心去除內毒素。精制多糖可以用于制備多糖疫苗或結合疫苗。其中，現有技術中去除蛋白質除了常用的苯酚抽提外，也可以用氯仿/正丁醇混合液抽提。

由于苯酚和氯仿都是有毒有害的化學危險品，有致癌的危險性，對工作條件、人員保護、污水處理等有較高要求。因此，在提制多糖過程中，盡量避免使用上述有毒害化學試劑是非常有益的。

有人嘗試用層析法純化多糖(黃鎮等，CN200610048875.4；Pato?TP等，JChromatB，2006，832：262-267.)。但這種方法操作復雜、處理量小、成本高，不易用于規模生產。

Hamidi等描述了用脫氧膽酸鈉鹽去除蛋白質的方法(US20070065460)，該方法可用于b型流感桿菌多糖的提制。然而，該方法所用試劑脫氧膽酸鈉鹽低毒，具有表面活性作用，對粘膜具有不可逆的損傷作用。

Costantino描述了用乙醇將陽離子去污劑沉淀的多糖重新溶解和多步驟過濾/超濾的方法(CN02812444.8，EP1741442)，用于提制A、Y、W135群腦膜炎球菌多糖。但該方法后續步驟較為復雜，需經多步過濾、篩分過濾或超濾，且提取物質的得率低。

目前，本領域迫切需要開發出一種適用于從帶莢膜細菌中簡便、高效、低成本地分離純化莢膜多糖，并避免使用有毒有害化學試劑的方法。

發明內容

本發明的目的正是提供一種細菌莢膜多糖的處理方法，該方法可簡便、可控、安全、有效地獲得高純度莢膜多糖。與其它方法相比，本發明的方法不使用有毒試劑苯酚或氯仿，提高多糖的回收率，簡化操作流程。本發明的另一目的是提供一種用上述處理方法所獲得的莢膜多糖及其用途。

在本發明的第一方面中，提供了一種細菌莢膜多糖的處理方法，所述方法包括：

(a)在含細菌莢膜多糖的沉淀物中加入終濃度為20-30體積％的低級醇，從而溶解所述莢膜多糖，形成混合液；

(b)對步驟(a)的所述混合液進行固液分離，然后收集上清液；

(c)在步驟(b)所得上清液中加入終濃度為60-90體積％的低級醇，從而形成含細胞莢膜多糖的粗沉淀物，然后收集所述粗沉淀物；

(d)在粗沉淀物中加入終濃度為30-70體積％的低級醇，從而使所述粗沉淀物中的多糖處于溶解狀態，然后對形成的混合液進行固液分離，收集上清液；

(e)在步驟(d)所得上清液中加入終濃度為60-90體積％的低級醇溶液，從而形成莢膜多糖沉淀物；

(f)收集步驟(e)中所得的莢膜多糖沉淀物，即為純化的細菌莢膜多糖，

其中，步驟(c)和步驟(e)中的低級醇終濃度高于步驟(d)中的低級醇終濃度。