[發明專利]番紅花病毒檢測方法

無效

• 申請號: 200810201020.X
• 申請日: 2008-10-10
• 公開（公告）號: CN101724710A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 秦路平;韓婷;楊弘;吳威巍
• 申請（專利權）人: 上海華宇藥業有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王巍

1.一種番紅花病毒檢測方法，其特征在于該檢測方法包括下列步驟：

(1)引物設計

根據番紅花病毒的核苷酸序列設計擴增番紅花病毒外殼蛋白的特異性引物，引物序列；

(2)總RNA提取：

①處理：取0.2g發病葉片，剪成小段，用液氮研磨成粉末狀，移入滅菌的1.5ml離心管中，然后加入1ml的Trizol試劑，劇烈振蕩搖勻；

②RNA分離：4℃，12000rpm離心10min以除去不溶的成分，將上清液轉入一新的1.5ml離心管中；

③RNA提取：室溫下保持5min，加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，然后在室溫下保持10min后，4℃，12000rpm離心15min；

④將上層水相轉移到新的1.5ml離心管中，加0.5ml異丙醇，室溫下靜置15min。4℃，12000rpm離心15min，RNA就會在管的側壁和底部形成沉淀；

⑤RNA洗滌：棄去上清液，加入75％的乙醇洗滌；混勻，4℃，12000rpm離心5min；

⑥棄去乙醇，沉淀于室溫下自然晾干，RNA溶于40ul?dH₂O中，保存于-70℃備用；

(3)RT-PCR擴增

①反轉錄合成cDNA

反轉錄以植物總RNA為模板，進行反轉錄合成cDNA，其反應體系為：3.0uL?RNA、2.0uL?5×RT緩沖液、1.0uL?dNTP/10mM、0.5uL?RNA酶抑制劑40U/uL、0.5uL反轉錄酶XL(AMV)5U/uL、0.5uL引物和2.5uL?dH₂O，混合均勻后，室溫放置10min，45℃水浴1h；

②PCR擴增

聚合酶鏈式反應以反轉錄產物為模板，用步驟(1)設計的引物，進行聚合酶鏈式反應，其反應體系如下，聚合酶鏈式反應的體系為2.0uL反轉錄產物、2.5uL?10×Taq緩沖液、1.0uLdNTP/10mM、0.5uL?Taq?DNA聚合酶、0.5uL上游引物、1.5uL下游引物和18uL?dH₂O；

(4)電泳檢測

取5uLPCR產物經0.8％-1.5％瓊脂糖凝膠中進行電泳，其反應體系為：4.5uL標物，2.0uL?10×loading?buffer，7.0uL?PCR產物，120V電壓，電泳結束后將凝膠于10ug/uL溴化乙錠中染色15min，于凝膠成像儀中觀察并記錄結果。

2.根據權利要求1所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(1)根據番紅花病毒的CMV核苷酸序列設計了擴增病毒的特異性引物為：

CMV(+)ATGGACAAATCTGAATCACCC；

CMV(-)TAAGCTGGATGGACAACCCGT。

3.根據權利要求1所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(1)根據番紅花病毒的PVY核苷酸序列設計了擴增病毒的特異性引物為：

PVY(+)GGNAAYAAYAGYGGNCARCC；

PVY(-)CAGGATCCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT。

4.根據權利要求1所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(1)根據番紅花病毒的TuMV核苷酸序列設計了擴增病毒的特異性引物為：

TuMV(+)GTGGCTTTAAACCTCGATCA；

TuMV(-)ACGCCAAGTAAGTTATGCAT。

5.根據權利要求1所述的番紅花病毒檢測方法，其特征在于步驟(1)根據番紅花病毒的TRV核苷酸序列設計了擴增病毒的特異性引物為：

TRV(+)GCTATGAAATTTGCGTTACA；

TRV(-)TTATGATACGCAGTAGAAGC。