[發明專利]用熒光標記核苷酸反轉錄檢測菌體RNA轉錄水平的方法

無效

• 申請號: 200810200931.0
• 申請日: 2008-10-09
• 公開（公告）號: CN101368216A
• 公開（公告）日: 2009-02-18
• 發明（設計）人: 董德賢;尹曉武;何靜;高倩;李榮秀
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種生物工程技術領域檢測方法，具體是一種用熒光標記核苷 酸反轉錄檢測菌體RNA轉錄水平的方法。

背景技術

發酵系統的參數檢測是大規模工業發酵過程優化和在線控制的基礎。當前，檢 測內容主要集中在環境變量、宏觀生物量和產品產率幾個方面。在環境、宏觀生物 量參數和產品之間，還存在著菌體內產品合成和調控的生化過程，如產品合成基因 和調控基因的DNA轉錄成為RNA，RNA翻譯成為蛋白質，以及酶促生化反應至產品等中 間過程環節。而目前菌體內的生化過程被視為“黑盒子”，無法利用產品生產能力的 “早期”生化信號，在環境變量、宏觀生物量和產品之間建立更“早期”信號關聯， 指導發酵過程的優化和在線控制技術提高。因此建立測定菌體發酵過程中RNA轉錄水 平的方法，對于工業發酵過程的優化具有重要意義。熒光染料是核酸探針中很重要 的一種標記物，熒光標記的核酸分子探針(probe)用于檢測核酸樣品中特定的核苷 酸序列，因而也可用來檢測菌體RNA轉錄水平。常用的熒光標記試劑有溴乙錠、TAMRA、 Cy(菁染料)系列及SYBR?Green?I等。在mRNA檢測定量的方法中，實時熒光RT-PCR (反轉錄聚合酶鏈式反應)運用了熒光標記試劑，生物芯片技術用到熒光標記單核 苷酸制備cDNA探針，這兩種方法步驟繁雜、耗時，影響因素較多。

經對現有技術的文獻檢索發現，石嶸等在第一軍醫大學學報2003年第23卷2期 124-126頁發表文章“兩種限制性標記方法提高基因芯片雜交結果的信噪比”，文中 利用Cy5-dUTP摻入逆轉錄cDNA，并用Cy5標記通用引物進行限制性PCR擴增，所得DNA 探針與芯片雜交后用GSI?Lumonics?Scanarry?Lite進行掃描，結果表明經過限制性 擴增的探針與芯片雜交結果的背景小，陽性信號強。但生物芯片技術也存在以下不 足：步驟較多，PCR擴增需要一定時間，另外雜交信號也需特殊的儀器檢測，價格昂 貴，不能普及。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供了一種用熒光標記核苷酸反轉錄檢測菌體RNA 轉錄水平的方法，即提取菌體的總RNA，反轉錄成cDNA。在反轉錄的過程中熒光標 記的核苷酸被反轉錄酶整合到新合成的cDNA產物中，使核酸信號得以放大。該檢測 過程無需傳統的PCR擴增和探針制備，可實現發酵過程的在線控制，是一種可以應 用到工業發酵過程控制的有用、便捷的方法。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下步驟：

第一步，引物的設計和合成

根據目的基因序列，設計RNA反轉錄引物。

第二步，RNA提取

提取菌體總RNA，利用OD_260/280和瓊脂糖電泳檢查RNA的純度和完整性。

第三步，mRNA熒光信號檢測

①在DEPC處理過的PCR管中依次加入Total?RNA，反轉錄引物，dATP、dTTP、dGTP、 dCTP，DEPC水；

②PCR儀中65℃保溫5～10min，取出后迅速置于冰上冷卻；

③向PCR管中依次加入反轉錄緩沖液及其反轉錄酶，熒光標記核苷酸；

④42～45℃保溫60～120min；

⑤94～98℃終止反應；

⑥加入氫氧化鈉，混勻，60～80℃保溫5min；

⑦12,000rpm，離心10min，取上清；

⑧醋酸中和，加入異丙醇，混勻，沉淀30min；

⑨12,000rpm，離心10min，用體積分數為70～90％乙醇洗滌沉淀。

⑩無菌水溶解沉淀，用熒光分析儀(如Fluoroskan?Ascent?Labsystems，美國 熱電公司產品)測定熒光信號。

所述RNA熒光信號檢測過程中避光操作。

所述的熒光標記核苷酸，其采用的熒光標記染料為Cy系列(菁類染料)、FAM、 Texas?Red(得克薩斯紅)中一種，但不限于上述熒光染料。

所述的核苷酸，為脫氧胞苷三磷酸或脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧 胸腺苷三磷酸。