[發明專利]用熒光標記核苷酸反轉錄檢測菌體RNA轉錄水平的方法

無效

• 申請號: 200810200931.0
• 申請日: 2008-10-09
• 公開（公告）號: CN101368216A
• 公開（公告）日: 2009-02-18
• 發明（設計）人: 董德賢;尹曉武;何靜;高倩;李榮秀
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1.一種用熒光標記核苷酸反轉錄檢測菌體RNA轉錄水平的方法，其特征在 于，包括如下步驟：

第一步，反轉錄引物設計：根據所測目的基因具體序列，設計上游引物用 于RNA的反轉錄；

第二步，提取菌體RNA，用OD_260/280和瓊脂糖電泳檢查RNA的純度和完整性；

第三步，熒光標記和熒光信號檢測：

①在DEPC處理過的PCR管中依次加入菌體RNA，反轉錄引物，dATP、dTTP、 dGTP、dCTP，DEPC水；

②PCR儀中65℃保溫5～10min，取出后迅速置于冰上冷卻；

③向PCR管中依次加入反轉錄緩沖液及其反轉錄酶，熒光標記核苷酸；

④42～45℃保溫60～120min；

⑤94～98℃終止反應，

⑥加入氫氧化鈉，混勻，60～80℃保溫5min；

⑦12,000rpm，離心10min，取上清；

⑧醋酸中和，加入異丙醇，混勻，沉淀30min；

⑨12,000rpm，離心10min，用乙醇洗滌沉淀；

⑩無菌水溶解沉淀，用熒光分析儀測定熒光信號。

2.根據權利要求1所述的用熒光標記核苷酸反轉錄檢測菌體RNA轉錄水平的 方法，其特征是，所述RNA熒光信號檢測過程避光操作。

3.根據權利要求1所述的用熒光標記核苷酸反轉錄檢測菌體RNA轉錄水平 的方法，其特征是，所述的熒光標記核苷酸，其采用的熒光標記染料為Cy系列、 FAM、Texas?Red中一種。

4.根據權利要求1或3所述的用熒光標記核苷酸反轉錄檢測菌體RNA轉錄 水平的方法，其特征是，所述的核苷酸為脫氧胞苷三磷酸、脫氧腺苷三磷酸、 脫氧鳥苷三磷酸或脫氧胸腺苷三磷酸中一種。

5.根據權利要求1所述的用熒光標記核苷酸反轉錄檢測菌體RNA轉錄水平 的方法，其特征是，第三步⑨中，所用乙醇，其體積分數為70～90％。