[發明專利]rhDSL重組蛋白及其制備方法

無效

• 申請號: 200810200665.1
• 申請日: 2008-09-27
• 公開（公告）號: CN101503470A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發明（設計）人: 韓偉;趙梅
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;C07K1/22;C07K1/18
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及一種生物工程技術領域的蛋白及其制備方法，具體涉及一種rhDSL重組蛋白及其制備方法。

背景技術

Notch信號傳導通路廣泛存在于脊椎和非脊椎動物中，是影響細胞決定的重要通路之一，在進化上具有高度的保守性。Notch信號傳導通路由Notch受體、配體及其下游的信號傳導共同組成。相鄰細胞間通過Notch受體傳遞信號可以調節包括干細胞在內的多種細胞的分化、增殖和凋亡，影響器官形成和形態發生。目前已經發現的人的Notch配體有Jaggedl、Jagged2、Deltal、Delta3、Delta4。Notch配體的胞外區含有數量不等的EGF樣重復序列以及N端保守的DSL(Delta/Serrate/Lag2)結構域，該DSL結構域在結合與活化Notch受體的過程中起關鍵作用。

來自于野生Notch配體的重組蛋白或者多肽被認為是有效的Notch激活劑。體外實驗已經證明，從Jaggedl、Deltal中衍生而來的重組蛋白及多肽具有Notch激活特性(Shimizu?K，et?al.J?Biol?Chem，1999，274(46)：32961～32969)。Han等(Blood，2000，95(5)：1616～1625)通過對人類Deltal蛋白結構的功能域的研究，成功的選出了具有Notch受體激活功能的Deltal最小功能蛋白序列，包括進化中的保守結構區DSL和與之相鄰的N-端的50個氨基酸，克隆并表達純化出具有GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)標簽的重組融合蛋白，命名為hD111^NDSL。經對現有技術的文獻檢索發現，中國專利公開號為CN101063127A，專利名稱為“GST-hDSL重組蛋白的制備方法”，該專利中介紹的制備方法步驟為“第一步，構建重組表達質粒pGEX-2T-hDSL；第二步，誘導表達重組表達質粒pGEX-2T-hDSL；第三步，將表達產物依次經變性，復性，離心，沖洗，洗脫后純化得到GST—hDSL重組蛋白的?！痹摲椒m然可以得到較高濃度(0.5mg/mL以上)和純度(95％以上)的GST-hDSL重組蛋白，但是所得到的重組蛋白分子量較大、結構較為復雜，不利于生產中成本的節約及相關體內外研究中的運用。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種rhDSL重組蛋白及其制備方法，使其進一步簡化了hD111^NDSL重組蛋白的結構，首次構建了含6×His(組氨酸)標簽的重組rhDSL蛋白，rhDSL是一種新的結構簡單、分子量較小的Notch配體衍生多肽。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明所涉及的rhDSL重組蛋白，為含有6×His(組氨酸)標簽的Notch配體Delta-like-1的衍生多肽。

所述的衍生多肽，由含有進化中的保守結構區DSL和與之相鄰的N-端的50個氨基酸構成，共99個氨基酸，其氨基酸序列為(Blood，2000，95(5)：1616～162)：

LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。

所述rhDSL重組蛋白以pQE30為表達載體構建重組表達質粒pQE30-hDSL，以大腸桿菌DH5α為宿主進行重組蛋白的表達，在大腸桿菌中表達后以包涵體形式存在。

本發明所涉及的rhDSL重組蛋白的制備方法，包括如下步驟：

第一步，構建rhDSL的重組表達質粒pQE30-hDSL；

第二步，以大腸桿菌DH5α為宿主表達rhDSL重組蛋白；

第三步，采用Q?Sepharose陰離子交換層析與金屬離子(Ni²⁺)親和層析相結合的純化方法進行rhDSL重組蛋白的純化，得到高純度(純度>99％)低內毒素含量的rhDSL重組蛋白。