[發(fā)明專利]rhDSL重組蛋白及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810200665.1
• 申請日: 2008-09-27
• 公開（公告）號: CN101503470A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓偉;趙梅
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;C07K1/22;C07K1/18
• 代理公司: 上海交達專利事務(wù)所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1、一種rhDSL重組蛋白，其特征在于為含有6×His組氨酸標簽的Notch配體Delta-like-1的衍生多肽，所述衍生多肽由含有進化中的保守結(jié)構(gòu)區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個氨基酸構(gòu)成，共99個氨基酸，其氨基酸序列為：

LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的rhDSL重組蛋白，其特征是，所述rhDSL重組蛋白，以pQE30為表達載體構(gòu)建表達質(zhì)粒pQE30-hDSL。

3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的rhDSL重組蛋白，其特征是，所述rhDSL重組蛋白，以大腸桿菌DH5α為載體進行重組蛋白的表達。

4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的rhDSL重組蛋白，其特征是，所述rhDSL重組蛋白，在大腸桿菌中表達后以包涵體形式存在。

5、一種如權(quán)利要求1所述的rhDSL重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步，構(gòu)建rhDSL的重組表達質(zhì)粒pQE30-hDSL；

第二步，以大腸桿菌DH5α為宿主表達rhDSL重組蛋白；

第三步，采用Q?Sepharose陰離子交換層析與金屬離子Ni²⁺親和層析相結(jié)合的純化方法進行rhDSL重組蛋白的純化，得到rhDSL重組蛋白。

6、如權(quán)利要求5所述的rhDSL重組蛋白的制備方法，其特征是，所述構(gòu)建rhDSL的重組表達質(zhì)粒pQE30-hDSL，是指：以重組質(zhì)粒pGEX-2T/hDSL為模板，PCR的方法擴增hDSL基因片段，包括進化中的保守結(jié)構(gòu)區(qū)DSL和與之相鄰的N-端的50個氨基酸，共99個氨基酸，共298bp；割膠回收后的PCR目的產(chǎn)物和原核表達質(zhì)粒pQE30經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII、BamH?I雙酶切，連接割膠回收后的酶切產(chǎn)物，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備的DH5α感受態(tài)細胞中，挑選陽性克隆，經(jīng)測序證實無突變且讀框正確。

7、如權(quán)利要求6所述的rhDSL重組蛋白的制備方法，其特征是，所述原核表達質(zhì)粒pQE30含6×His標簽。

8、如權(quán)利要求5所述的rhDSL重組蛋白的制備方法，其特征是，所述以大腸桿菌DH5α為宿主表達rhDSL重組蛋白，是指：挑取pQE30-hDSL質(zhì)粒的DH5α的單菌落，25～30mL?LB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日將過夜菌液按2％的接種量轉(zhuǎn)接到1L～2L的LB培養(yǎng)基內(nèi)，轉(zhuǎn)接后37℃培養(yǎng)2.5～3.0h左右，待OD600＝0.6～0.8的時候停止培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)表達4h，收集菌體。

9、如權(quán)利要求8所述的rhDSL重組蛋白的制備方法，其特征是，所述LB培養(yǎng)基含100μg/mL?Amp。

10、如權(quán)利要求5所述的rhDSL重組蛋白的制備方法，其特征是，所述rhDSL重組蛋白的純化，是指：收集的菌體經(jīng)超聲裂解和溶菌酶裂解細菌后，離心，收集沉淀包涵體，包涵體經(jīng)8M尿素變性后，用稀釋法緩慢復(fù)性，取復(fù)性后的上清液經(jīng)Q?Sepharose陰離子交換層析，得到初步純化的rhDSL重組蛋白，將陰離子交換層析后所得蛋白溶液進一步通過金屬離子Ni²⁺親和層析并透析，得到rhDSL重組蛋白。