[發明專利]阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養方法

無效

• 申請號: 200810187966.5
• 申請日: 2008-12-31
• 公開（公告）號: CN101768585A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 李文建;王曙陽;陳積紅;劉敬;頡紅梅
• 申請（專利權）人: 中國科學院近代物理研究所
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 夏晏平

技術領域

本發明涉及微生物菌種選育的領域，尤其是采用重離子12C+6輻照誘變。

背景技術

優良的微生物菌種是發酵工業的基礎和關鍵，要使發酵工業產品的種類、產量和質量有較大的改善，首先必須選育性能優良的生產菌種。目前常用的發酵微生物菌種選育技術，一種是常規的誘變育種方法，另一種是分子育種方法。常規的誘變育種方法采用物理誘變因子如紫外線等進行誘變育種，或者采用化學誘變因子如硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍、氯化鋰、香豆素等進行誘變育種，或者采用物理因子和化學因子的復合誘變育種。常規育種具有盲目性強，工作量大、成功率低，而且現有的生產菌種對以往常用的物理和化學方法均表現出不同的抗性。分子育種方法是采用原生質體融合技術和DNA重組技術等一系方法選育菌種，該方法操作難度大，而且由于發酵工業生產規模大，基因工程菌經反擴大培養很容易引起質粒失活甚至丟失，造成基因表達困難。因此尋找新的誘變育種方法是迫切要解決的問題。

阿維菌素是當今最受關注的生物殺蟲殺螨劑之一，是被推薦使用的高效低毒農藥，阿維菌素(Avermectin)是由阿佛曼鏈霉素經液體發酵加工而成，與傳統農、獸藥相比，具有高效、廣譜、劑量小、適口性好、有效期長、不易產生抗藥性，易降解，無殘留等特點，且不易產生耐藥性，與其他殺蟲藥無交叉抗性。在土壤降解快、光解迅速。對作物安全，不易產生藥害。目前：影響其發展的主要原因為：作為菌種的阿佛曼鏈霉菌發酵效價提升緩慢，甚至長期得不到突破性進展。

天然阿維菌素中含有8個組分，主要有4種即A1a、A2a、B1a和B2a，其總含量≥80％；對應的4個比例較小的同系物是A1b、A2b、B1b和B2b，其總含量≤20％。目前市售阿維菌素農藥是以abamectin為主要殺蟲成分(AvermectinB1a+B1b，其中B1a不低于90％、B1b不超過5％)，以B1a的含量來標定。

AVMB1a分子式：C₄₈H₇₂O₁₄(R＝C₂H₅)

AVMB1a分子量：872

阿維菌素為白色或淡黃色結晶物，熔點為157-162℃，α(CHCl3)＝+55.7在237、245、254nm處均有吸收峰，λmax＝244±2nm，阿維菌素溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇等溶劑，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度極低(10μg/l)，本品應在干燥、密閉、陰涼遮光下保存。分子中無酸性或堿性官能團，在一般條件下穩定，在PH5-9時不會水解，無腐蝕性，對環境安全。

阿佛曼鏈霉菌菌種的選育時，經紫外線和亞硝基胍反復處理，菌種的發酵效價得到了顯著的提高，從野生菌種發酵效價的10微克/毫升提高到了目前的4000微克/毫升，但是再提高已經非常困難，嚴重影響了生產規模，生產成本居高不下。業內人士目前面臨的主要問題是尋求一種能提高菌種選育技術水平的好方法，以便得到一種對阿維菌素深層培養的高產優質菌種和達到大幅度降低生產成本的目的。

發明內容

本發明的目的為提供一種正突變變率高，發酵效價高、誘變條件可控可調可多次重復的阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養方法。

菌種的中能重離子束輻照誘變是一種新近發現的獨特的物理誘變方法，因為重離子束具有參數多樣，LET大，RBE高等特性，利用它可提高突變率，拓寬突變譜，縮短育種周期，是近年來輻射育種的一種新方法。

實現上述發明目的的技術方案為阿佛曼鏈霉素菌種用¹²C⁺⁶重離子束輻照進行誘變，輻照劑量范圍為40-70Gy，優選劑量為50Gy。

阿佛曼鏈霉菌種的重離子輻照誘變及輻照菌種的培養方法的具體步驟：

(1)阿佛曼鏈霉素菌種孢子懸液用¹²C⁺⁶重離子束輻照進行誘變；

(2)將輻照誘變后的孢子懸液和出發菌種的孢子懸液分別進行梯度稀釋，用生理鹽水稀釋至10^-4-10^-5倍；

(3)將稀釋的懸液準確轉到分離平板培養基上，涂抹均勻，分離單個菌落，測定最佳正突變率最佳誘變劑量；

(4)對突變明顯的菌落，用接種環取菌落孢子接種在斜面培養基上；

(5)將(3)的平板培養基與(4)的斜面培養基包扎后置于28℃恒溫箱中培養6天，再置于2-4℃冰箱中等待菌種接種；