[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)成體表皮細(xì)胞去分化的非轉(zhuǎn)基因方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810169475.8
• 申請(qǐng)日: 2008-10-21
• 公開（公告）號(hào): CN101724601A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付小兵;孫同柱;孫曉艷;蔡颯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/08
• 分類號(hào): C12N5/08
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及表皮干細(xì)胞研究領(lǐng)域。具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)成體表 皮細(xì)胞去分化獲得表皮干細(xì)胞的非轉(zhuǎn)基因方法。

背景技術(shù)

干細(xì)胞的研究一直是一項(xiàng)世界性的熱門課題，其意義不僅在于它蘊(yùn)含許多 深?yuàn)W的基礎(chǔ)性科學(xué)問(wèn)題沒(méi)有解決，更重要的是在于它具有巨大的臨床治療性應(yīng) 用前景和商業(yè)開發(fā)價(jià)值。2007年，有關(guān)從成體細(xì)胞通過(guò)去分化途徑，即重編程 過(guò)程獲得“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞”(Induced?Pluripotent?Stem?Cell，iPS)相關(guān)結(jié)果的發(fā) 表，給干細(xì)胞研究注入了新的活力，引起了人們極大的興趣，并被預(yù)言將有可 能代替核移植技術(shù)而成為干細(xì)胞研究的主導(dǎo)技術(shù)。

實(shí)際上有關(guān)成體細(xì)胞可以通過(guò)去分化途徑轉(zhuǎn)變成為干細(xì)胞的現(xiàn)象，早在本 世紀(jì)初人們就已經(jīng)在角膜、神經(jīng)以及腎臟等多個(gè)組織和器官中觀察到。即在一 定條件下已經(jīng)分化的成體細(xì)胞可以通過(guò)去分化途徑轉(zhuǎn)變成為相應(yīng)組織的干細(xì)胞 或干細(xì)胞樣細(xì)胞^[3-5]。但是，當(dāng)時(shí)這些發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有引起人們太多的關(guān)注與重視， 甚至有些發(fā)現(xiàn)還被認(rèn)為是一種“不可能”或“突發(fā)的異想”等等。直到2007年，相 繼有Yamanaka、Thomson、Plath、Jaenisch、Daley等日本和美國(guó)科學(xué)家在國(guó)際 著名雜志Cell、Nature、Science以及Cell?Stem?Cell等發(fā)表通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法將動(dòng) 物和人的皮膚成纖維細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成為iPS之后，人們才回過(guò)頭來(lái)進(jìn)一步重 視這一生物學(xué)現(xiàn)象并深入開展相應(yīng)研究。早在2001年，我們實(shí)驗(yàn)室就在Lancet 雜志首次報(bào)道了在愈合的人體皮膚潰瘍創(chuàng)面，表皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (EGF)作用后，可以去分化轉(zhuǎn)變?yōu)楸砥じ杉?xì)胞或表皮干細(xì)胞樣細(xì)胞的初步發(fā)現(xiàn) ^[8]。在此基礎(chǔ)上，我們實(shí)驗(yàn)室近幾年來(lái)一直致力于“如何從在體與離體條件通過(guò) 非轉(zhuǎn)基因的途徑將表皮細(xì)胞去分化成為表皮干細(xì)胞或表皮干細(xì)胞樣細(xì)胞的研 究”，并在以下幾方面獲得突破：1)通過(guò)非轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞因子組合培養(yǎng)技術(shù)， 已經(jīng)方便的將已分化的人表皮細(xì)胞成功誘導(dǎo)成為表皮干細(xì)胞或表皮干細(xì)胞樣細(xì) 胞，并可在體外大量擴(kuò)增，為成體干細(xì)胞遺傳學(xué)變化特征的研究提供了可靠來(lái) 源；在裸鼠創(chuàng)面，通過(guò)人皮片移植技術(shù)，可在體獲取經(jīng)去分化途徑來(lái)源的表皮 干細(xì)胞，經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)，這些去分化來(lái)源 的表皮干細(xì)胞不僅具有類似于正常皮膚表皮干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，如核大、核 漿比例小等，而且可以重新表達(dá)表皮干細(xì)胞的重要標(biāo)志，如角蛋白19(K19)、β₁ 整合素、α₆和CD71等。去分化來(lái)源的表皮干細(xì)胞的核型檢查也與正常表皮干 細(xì)胞一致；2)初步闡明在表皮細(xì)胞去分化產(chǎn)生表皮干細(xì)胞的過(guò)程中涉及的信號(hào) 通路主要有Wnt和ERK的激活；3)證明了這種去分化來(lái)源的表皮干細(xì)胞與正 常的表皮干細(xì)胞具有相似的功能，如將這種去分化來(lái)源的表皮干細(xì)胞與真皮基 質(zhì)復(fù)合，可以產(chǎn)生出與正常表皮干細(xì)胞所產(chǎn)生的類似的皮膚三維結(jié)構(gòu)；4)將上 述非轉(zhuǎn)基因方法誘導(dǎo)形成的去分化來(lái)源的表皮干樣細(xì)胞再次進(jìn)行組織特異性分 化誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)可形成表皮細(xì)胞，而誘導(dǎo)形成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞以及其它類型細(xì) 胞的幾率很低，組織特異性標(biāo)記物鑒定只有不足0.5-1％的其它類型細(xì)胞出現(xiàn)。 這一現(xiàn)象確證了這些去分化來(lái)源的表皮干細(xì)胞是組織特異性干細(xì)胞，但同時(shí)也 提示如果條件適宜，非轉(zhuǎn)基因方法有可能進(jìn)一步誘導(dǎo)形成多能干細(xì)胞，值得進(jìn) 一步探索；5)將上述非轉(zhuǎn)基因方法誘導(dǎo)形成的表皮干細(xì)胞接種NOD/SCID鼠 未觀察到腫瘤發(fā)生(包括畸胎瘤)。上述初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：1)通過(guò)非轉(zhuǎn)基 因的方法是一種重要的獲得組織干細(xì)胞的途徑^[11，12]；2)通過(guò)建立適當(dāng)?shù)脑隗w 與離體誘導(dǎo)方法，我們目前已經(jīng)可以將成體細(xì)胞通過(guò)去分化途徑轉(zhuǎn)變成為特異 性的組織干細(xì)胞，但還不能有效推進(jìn)到多能干細(xì)胞的水平，表明細(xì)胞在去分化 重編程過(guò)程中具有嚴(yán)密的等級(jí)發(fā)生規(guī)律，是一個(gè)有序的生物學(xué)過(guò)程，可能在這 一過(guò)程中有關(guān)的關(guān)鍵基因的激活人們還不清楚；3)從臨床應(yīng)用角度來(lái)講，非轉(zhuǎn) 基因方法獲得的組織特異干細(xì)胞應(yīng)該比轉(zhuǎn)基因方法獲得的干細(xì)胞更安全和方便 使用。