[發明專利]一種羊X/Y精子分離冷凍精液及其生產方法和應用

有效

• 申請號: 200810135352.2
• 申請日: 2008-08-01
• 公開（公告）號: CN101347458A
• 公開（公告）日: 2009-01-21
• 發明（設計）人: 李喜和;王建國;錢松晉;胡樹香;周文忠
• 申請（專利權）人: 內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司
• 主分類號: A61K35/52
• 分類號: A61K35/52;C12N5/06;A61P15/00
• 代理公司: 北京漢德知識產權代理事務所（普通合伙）
• 代理人: 王錚;嚴勇剛

技術領域

本發明涉及一種家畜X/Y精子分離技術，特別涉及一種羊X/Y精子分離冷 凍精液及其生產方法和應用。

背景技術

以家畜為主的冷凍精液、人工受精和體外受精技術廣泛應用于生產繁育和 生殖生物學研究。在正常情況下，羊(綿羊和山羊)的子代繁育公母各占50％， 但是在生產實際中，為了提高羊(綿羊和山羊)的養殖效應，對于特定品系需 要更多繁育母羔(綿羊、山羊育種和擴群)或公羔(商品羊肉生產、商品羊絨 生產)，于是就需要通過分離X/Y精子來控制羊(綿羊和山羊)的子代性別。 CN1232231C公開了一種家畜X/Y精子分離的方法，但該方法需要使用磷酸緩 沖溶液洗滌精液，通過流式細胞分離機分離，其速度為3000個/秒。然而，使用 該方法分離羊的X/Y精子時，其分離速度、分離準確率、緩沖液使用、冷凍保 存后的精子活力等方面仍有較大提高空間。

CN101112392A公開了一種底劑量家畜精液及其生產方法，該方法通過使 用冷凍平衡液A(Tris-A)和添加了甘油的冷凍平衡液B(Tris-B)來處理多種家畜 精液，通過多種動物精液生理特性研究，發現特定異種動物精子間的受精促進 效果。該方法需要添加異種家畜的精液，使用該方法的山羊+綿羊精子冷凍液的 受胎率為51％，在仍有提升的空間。

發明內容

本發明的目的是提供羊X/Y精子分離冷凍精液的生產及方法和應用，可以 將羊X/Y精子分離，并實現產業化生產和應用，從而控制羊的子代性別。

本發明提供了一種羊X/Y精子分離冷凍精液，包括冷凍平衡液A、冷凍平 衡液B和羊X或Y精子分離冷凍精液，其含量如下：

冷凍平衡液A??Tris-A??50％

冷凍平衡液B??含12％甘油冷凍保護劑的Tris-B??50％，其中：

羊X或Y精子分離冷凍精液濃度為50-200萬精子/0.25mL。

上述冷凍平衡液A，pH?6.8，由以下組分組成：

冷凍平衡液B，pH?6.8，由以下組分組成：

本發明還提供了上述羊X/Y精子分離冷凍精液的生產方法，包括下述步驟：

1)從健康的公羊采集新鮮精液2-5mL(總精子數25-50億個)，為抑制精液 中細菌增殖添加抗生素(泰樂菌素Tylosin：0.103mg/mL，慶大霉素 Gentamicin：0.508mg/mL，林可-奇霉素Linco-spectin：0.6mg/mL)，在18-20℃條 件下保溫，每份新鮮精液在該條件下可使用10-12小時；

2)使用精子密度-活力儀檢測新鮮精液的濃度和活力，只有活力在80％以 上的樣品可用于分離處理，根據精液濃度折合體積取4億精子離心去除精漿， 添加10μg/mL?Hochest?33342在24℃溫水浴中染色20分鐘；

3)羊X/Y精子分離的DNA含量差異設定為3.2-3.4％，根據羊X/Y精子 DNA含量差別設定流式細胞分離機參數(第一相區初取精子噴流總數的80％/ 第二相區原精液死精率10％＝X/Y單性精子分離取率45-47％)，通過流式細胞分 離機分離X和Y精子，使羊X/Y精子分離速度控制在5000-7000個/秒，X或Y 精子分離純度達到85-95％；

4)根據分離精子累計顯示，取經過分離的X或Y精子按1-1.1億，下機后 以2000轉/5分鐘離心處理，用顯微鏡-電腦精子記數法檢測分離精子濃度，用 冷凍平衡液A稀釋到最終設計濃度的2倍，在4-5℃條件下放置90分鐘以上；

5)冷凍平衡液A平衡后，添加等量的含12％甘油冷凍保護劑的冷凍平衡液 B，在4℃下平衡30分鐘；

6)4℃條件下把步驟5)得到的經分離的X或Y精液裝入冷凍管，制成含 羊X/Y精子分離冷凍精液。

7)因為冷凍保護液的效果不同，進一步將步驟6)制得的羊X/Y精子分離 冷凍精液置入-90℃的氮蒸汽中處理20-30分鐘；當溫度降到-120℃時，把冷凍 管投入液化氮中保存。

上述羊X/Y精子分離冷凍精液用于常規人工授精或手術人工授精方法，每 只受體一次可輸入50-200萬分離精子，按照生產需要定向繁育公羔或母羔；或 者，通過羊X/Y精子分離冷凍精液生產性控胚胎，再進行胚胎移植加快優良個 體的繁育速度。