[發明專利]一種羊X/Y精子分離冷凍精液及其生產方法和應用

有效

• 申請號: 200810135352.2
• 申請日: 2008-08-01
• 公開（公告）號: CN101347458A
• 公開（公告）日: 2009-01-21
• 發明（設計）人: 李喜和;王建國;錢松晉;胡樹香;周文忠
• 申請（專利權）人: 內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司
• 主分類號: A61K35/52
• 分類號: A61K35/52;C12N5/06;A61P15/00
• 代理公司: 北京漢德知識產權代理事務所（普通合伙）
• 代理人: 王錚;嚴勇剛

1.一種羊X/Y精子分離冷凍精液的生產方法，包括下述步驟：

1)采集公羊新鮮精液2-5mL，添加抗生素，在18-20℃條件下保溫；

2)檢測新鮮精液的濃度和活力，只有活力在80％以上的樣品可用于分離處 理，根據精液濃度折合體積取4億精子離心去除精漿，添加10μg/mL?Hochest 33342在24℃溫水浴中染色20分鐘；

3)羊X/Y精子分離的DNA含量差異設定為3.2-3.4％，根據羊X/Y精子 DNA含量差別設定流式細胞分離機參數為第一相區初取精子噴流總數的80％/ 第二相區原精液死精率10％＝X/Y單性精子分離取率45-47％，通過流式細胞分 離機分離X和Y精子，使羊X/Y精子分離速度控制在5000-7000個/秒；

4)取分離的X或Y精子1-1.1億，下機后以2000轉/5分鐘進行離心處理， 然后用冷凍平衡液A稀釋到50-200萬精子/0.25mL的2倍，在4-5℃條件下放置 90分鐘以上，其中冷凍平衡液A的pH為6.8，由以下組分組成：291.7mM的 三羥甲基氨基甲烷、95.1mM的檸檬酸、70.2mM的果糖、20％的卵黃和超純水；

5)所述冷凍平衡液A平衡后，添加等量的冷凍平衡液B，在4℃下平衡30 分鐘，其中所述冷凍平衡液B的pH?6.8，由以下組分組成：291.7mM的三羥甲 基氨基甲烷、95.1mM的檸檬酸、70.2mM的果糖、20％的卵黃、12％的甘油和 超純水；

6)把分離X或Y精液在4℃條件下裝入冷凍管，制成羊X/Y精子分離冷凍 精液。

2.根據權利要求1的所述的生產方法，其特征在于：所述抗生素為泰樂菌素 0.103mg/mL，慶大霉素：0.508mg/mL，林可-奇霉素：0.6mg/mL。

3.根據權利要求1所述生產方法生產的羊X/Y精子分離冷凍精液在人工受精或 者生產性控胚胎并進行胚胎再移植中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：其中取所述羊X/Y分離冷凍精液 人工授精劑量為50-200萬精子/只或次。