[發(fā)明專利]膠體金免疫層析法檢測(cè)牛白血病抗體的試紙條及其制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810122729.0
• 申請(qǐng)日: 2008-06-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101303351A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋陽(yáng)威;張?chǎng)斡?/a>;張常印;孫懷昌;吳亞力;何玲;張敬友
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中華人民共和國(guó)徐州出入境檢驗(yàn)檢疫局
• 主分類號(hào): G01N33/558
• 分類號(hào): G01N33/558;G01N33/531;G01N33/52
• 代理公司: 徐州市三聯(lián)專利事務(wù)所
• 代理人: 何君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種牛白血病病毒(BLV)囊膜糖蛋白gp51體外表達(dá)、分離純 化，和膠體金免疫層析法檢測(cè)牛白血病抗體的試紙條及其制備方法，屬動(dòng)物檢 疫檢測(cè)技術(shù)，主要應(yīng)用于公共衛(wèi)生領(lǐng)域。

背景技術(shù)

BLV檢測(cè)方法主要有病毒直接檢測(cè)、血清學(xué)方法、分子生物學(xué)方法以及其 他方法。目前已有的血清學(xué)方法主要有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)、間接免疫熒光 試驗(yàn)(IIFA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFA)、放謝免疫試驗(yàn)(RIA)及酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)(ELISA)等。但瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)周期稍長(zhǎng)，一般需要一到兩天的時(shí)間， 而ELISA方法檢測(cè)速度相對(duì)來(lái)說(shuō)較快(需要數(shù)小時(shí))，目前使用的檢測(cè)試劑盒 為美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)，但是其價(jià)格昂貴，普及使用受到極大的影響，而且需 要酶標(biāo)儀等儀器設(shè)備。BLV感染最常用的檢測(cè)方法就是血清學(xué)方法，雖然這些 方法操作簡(jiǎn)單，能有效地檢測(cè)BLV的感染，防止其流行，然而這些方法也存在 著某些不可彌補(bǔ)的局限性，如①在病毒早期階段不能測(cè)出抗體，不能檢出早期 感染；②易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；③由于新生小牛能從母乳中 獲得抗體，因此血清學(xué)方法不能被動(dòng)免疫或主動(dòng)免疫；④檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)； ⑤檢測(cè)費(fèi)用昂貴等。另外，不同的血清學(xué)方法檢測(cè)BLV陽(yáng)性血清，其敏感程度 也不一樣。Monti?GE等(2005)在研究實(shí)驗(yàn)性感染BLV牛陽(yáng)性血清轉(zhuǎn)變時(shí)間時(shí) 發(fā)現(xiàn)，AGID比ELISA檢出時(shí)間要早，但Reichel等(1998)發(fā)現(xiàn)ELISA試驗(yàn)比 AGID和電泳免疫印跡(EIB)敏感性提高10％，多檢出約10％的反應(yīng)血清。即使 同一種檢測(cè)方法，其敏感程度也不一樣，MPRidge?SE等(2005)通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)， 在目前較靈敏的Lactelisa?ELISA法可檢測(cè)稀釋200倍奶樣中BLV抗體。 Antonio?DG等(2004)利用重組桿狀病毒表達(dá)了BLV?gp51，并用該表達(dá)的gp51 研制出檢測(cè)BLV陽(yáng)性血清的ELISA檢測(cè)方法，該方法與傳統(tǒng)的BLV?ELISA檢測(cè) 方法相比，符合率為99％，與AGID相比，符合率為100％，且將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清 稀釋1600倍時(shí)，檢測(cè)結(jié)果仍顯示強(qiáng)陽(yáng)性，而這兩種ELISA方法都會(huì)增加假陽(yáng) 性的幾率。免疫膠體金快速診斷技術(shù)是目前較常使用的一項(xiàng)技術(shù)，且有逐漸取 代ELISA的等檢測(cè)方法的趨勢(shì)。隨著膠體金免疫層析技術(shù)的逐步完善，譬如可 以對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，以及可以定量檢測(cè)等，使其更易得到市場(chǎng)的青睞。 而免疫膠體金快速診斷技術(shù)的無(wú)污染、便捷、靈敏、安全，不僅更適合于未來(lái) 環(huán)保型社會(huì)，而且利于野外檢測(cè)，有著相當(dāng)大的應(yīng)用前景。其優(yōu)點(diǎn)具體表現(xiàn)在 以下幾方面：①快捷迅速，大大縮短出結(jié)果時(shí)間。出結(jié)果的時(shí)間都在幾分鐘之 內(nèi)，這是目前其它快速檢測(cè)方法所無(wú)法達(dá)到的，如市場(chǎng)上銷售的金標(biāo)hCG快速 檢測(cè)紙條一般1-2min內(nèi)就能出結(jié)果，這種快速與膠體金本身顯色特點(diǎn)有關(guān)， 也與免疫層析法以及“免疫濃縮”有關(guān)，而其他如ELISA法出結(jié)果要1-2h；PCR 步驟繁瑣，耗時(shí)甚長(zhǎng)。②靈敏準(zhǔn)確，結(jié)果受外因影響較少。免疫膠體金快速診 斷方法并不因?yàn)槠淇焖俣鵂奚怂撵`敏準(zhǔn)確性。如用GICA試紙條檢測(cè)HBsAg 標(biāo)準(zhǔn)品，靈敏度可達(dá)1ng/ml。用GICA與酶免疫法比較檢測(cè)了395份不同血清 標(biāo)本中HBsAg，兩法符合率為99.0％。此外，由于膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)是一物理 結(jié)合過(guò)程，結(jié)合牢固，很少引起蛋白質(zhì)活性改變，所以試劑非常穩(wěn)定，不受溫 度等外界因素影響，可在實(shí)驗(yàn)室，甚至野外進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可長(zhǎng)期保存。 ③安全簡(jiǎn)便，不需任何儀器和設(shè)備。免疫膠體金檢測(cè)方法不需任何儀器和設(shè)備， 只需制備好的試紙條或試劑盒即可，由于膠體金本身具有顏色，比ELISA省略 了加顯示劑和終止液的步驟，大大簡(jiǎn)化了操作，更適合于野外臨床的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。 因?yàn)闆](méi)有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與，所以也不會(huì)污染環(huán)境， 具有放射性同位素或酶標(biāo)等檢測(cè)方法所無(wú)法比擬的安全性。④成本低廉，所需 試劑和樣本量少。因?yàn)椤懊庖邼饪s”效應(yīng)存在，免疫膠體金實(shí)驗(yàn)所需試劑和樣 本量都非常少，樣本量可低至1-2ul，再加上無(wú)需任何儀器和設(shè)備，并且可單 份標(biāo)本檢測(cè)，使成本大幅下降。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)將膠體金診斷試紙應(yīng)用到檢測(cè) BLV感染方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容