[發明專利]一種用昆蟲卵建立細胞系的方法

有效

• 申請號: 200810118629.0
• 申請日: 2008-08-20
• 公開（公告）號: CN101423817A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發明（設計）人: 張永安;溫發園;王玉珠;曲良建;王文歡
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 朱麗華

技術領域

本發明涉及一種生物技術，尤其涉及一種用昆蟲卵建立細胞系的方法。

背景技術

自1965年第一株昆蟲細胞系成功建立后至今，近40年的時間內，已經建立的昆蟲細胞系超過500種。昆蟲細胞系作為研究材料，一直是生理學、發育生物學、細胞生物學、分子生物學和生物化學等科學研究的重要工具，而且昆蟲細胞作為桿狀病毒表達載體系統的重要組成部分，表達了大量的具有重大經濟意義或科學意義的外源蛋白質；同時作為生物反應器，擴增昆蟲桿狀病毒用作生物殺蟲劑，特別是擴增含有外源基因的重組桿狀病毒殺蟲劑，昆蟲細胞也發揮了重要的作用。

大量的來源于鱗翅目昆蟲商品化的細胞系已得到人們廣泛的應用。鱗翅目的細胞系來源于很多組織，包括卵巢、胚胎、血細胞、脂肪體等。對于每一株細胞系，無論是來自同一種昆蟲甚至同一個體，同一器官組織，在細胞系的建立和細胞的培養過程中，都會出現不同程度的變異，其細胞生物學特性，對特定桿狀病毒的感受性都有可能不同。因而科學家們根據研究的需要或某些商業目的，會嘗試從不同種昆蟲，同一昆蟲不同器官組織中，建立和篩選各種類型的細胞系，以滿足不同的需求。

傳統的昆蟲細胞系的建立方法，帶有很大的隨機性和不確定性。多將相應的昆蟲器官或組織剪碎，或用胰蛋白酶把昆蟲組織消化，釋放出單個或成團的細胞，放入特定的細胞培養液中培養，并定時更換培養液。昆蟲胚胎細胞系的建立方法，多是將多個昆蟲卵粒用勻漿器研碎過濾后培養，對胚胎細胞傷害很大。因此，細胞系建立成功與否隨機性很強，有很大的不確定性，多數情況下以失敗告終，而且這個過程很長，一般一個細胞系建立成功需要1.5-2年甚至更長時間。

發明內容

本發明的目的是提供一種用昆蟲卵建立細胞系的方法，其能夠快速、有效、可重復地建立昆蟲細胞系。

為實現上述目的，本發明采用如下方法：

一種用昆蟲卵建立細胞系的方法，方法步驟如下：

1)將產下90-100小時的昆蟲卵受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡5-10分鐘后用無菌水清洗，再將卵粒用乙醇溶液消毒后用生理鹽水Ringer’s清洗；

2)將上述步驟處理后的卵粒倒入昆蟲細胞培養液中，逐一輕擠壓卵粒釋放出胚胎；

3)將步驟2)得到的胚胎剪碎成組織塊，轉入密閉培養瓶中，放入25～28℃無光照的細胞培養箱中培養20～30小時；

4)加入細胞培養液，使胚胎的組織塊完全或超半部分浸沒在該培養液中，在與步驟3)同樣條件下培養；

5)每7-15天更換培養液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿了整個培養瓶；

6)從培養瓶中吸出半量的細胞培養液，其中含有新增殖出的單個細胞，放入新培養瓶中，并加入等量的新細胞培養液；而原培養瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養液；將兩個培養瓶再放回培養箱中與步驟3)同樣條件下培養；得到昆蟲卵胚胎第一代傳代細胞，細胞系建立成功；

整個過程都是在無菌條件下進行的。

所述的昆蟲卵尤指鱗翅目昆蟲卵，如可以是：楊扇舟蛾卵或美國白蛾卵、春尺蠖卵。

本發明所使用的細胞培養液是常規采用的昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細胞培養液pH在6.2-6.6之間。昆蟲細胞培養液可以是各種商品化的昆蟲細胞培養液，如TNM-FH，Grace’s，TC-100，IPL-41，Ex-ell?405等等。

本發明所使用的細胞培養液中青霉素與鏈霉素的含量各為50～100U/mL；動物血清含量為細胞培養液的體積比為5％～15％。

本發明的積極效果是：本發明方法可以在短期內建立需要研究或生產用的昆蟲細胞系，能夠提供大量的昆蟲細胞種類的來源，并供使用者篩選，使建立細胞系成為實驗室的常規實驗方法成為可能。

具體實施方式

本發明用昆蟲卵建立細胞系的方法具體步驟如下：

(1)將產下約四天(90-100小時)的受精卵片放入10ml試管中，然后用10％次氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘并輕振蕩，倒掉次氯酸鈉溶液并用無菌水清洗卵粒，倒掉無菌水后用75％乙醇溶液消毒卵粒10-20分鐘，期間不斷輕輕振蕩，倒掉乙醇后用Ringer’s清洗卵粒；

(2)將卵粒倒入或用移液器移入裝有1-2ml的昆蟲細胞培養液中，在解剖鏡下用彎頭眼科鑷逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；

(3)用移液器輕輕轉移胚胎入另一裝有0.5mL昆蟲細胞培養液的培養皿中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度約1-2mm。用移液器將胚胎組織塊轉入含有0.5mL細胞培養液潤洗過的細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27℃無光照的細胞培養箱中培養24小時；