[發(fā)明專利]一種用昆蟲卵建立細胞系的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810118629.0
• 申請日: 2008-08-20
• 公開（公告）號: CN101423817A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發(fā)明（設計）人: 張永安;溫發(fā)園;王玉珠;曲良建;王文歡
• 申請（專利權）人: 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司
• 代理人: 朱麗華

1.一種用昆蟲卵建立細胞系的方法，方法步驟如下：

1)將產下90-100小時的昆蟲受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡5-10分鐘后用無菌水清洗，再將卵粒用乙醇溶液消毒后用生理鹽水Ringer’s清洗，其中所述的昆蟲卵為楊扇舟蛾卵或美國白蛾卵、春尺蠖卵；

2)將上述步驟處理后的卵粒倒入昆蟲細胞培養(yǎng)液中，逐一輕擠壓卵粒釋放出胚胎；

3)將步驟2)得到的胚胎剪碎成組織塊，轉入密閉培養(yǎng)瓶中，放入25～28℃無光照的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～30小時；

4)加入細胞培養(yǎng)液，使胚胎的組織塊完全或超半部分浸沒在該培養(yǎng)液中，在與步驟3)同樣條件下培養(yǎng)；

5)每7-15天更換培養(yǎng)液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿了整個培養(yǎng)瓶；

6)從培養(yǎng)瓶中吸出半量的細胞培養(yǎng)液，其中含有新增殖出的單個細胞，放入新培養(yǎng)瓶中，并加入等量的新細胞培養(yǎng)液；而原培養(yǎng)瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養(yǎng)液；將兩個培養(yǎng)瓶再放回培養(yǎng)箱中與步驟3)同樣條件下培養(yǎng)；得到昆蟲胚胎第一代傳代細胞，細胞系建立成功；

整個過程都是在無菌條件下進行的。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：繼續(xù)得到昆蟲卵胚胎后一代傳代細胞的方法步驟如下：周期重復權利要求1所述的步驟5)及步驟6)。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟1)中用5％-20％的次氯酸鈉溶液浸泡昆蟲受精卵片2-15分鐘，或用0.2％-1％的甲醛溶液浸泡10-30分鐘，用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡及用乙醇溶液消毒期間均可不斷輕輕振蕩。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：胚胎剪碎成1-2mm組織塊，所述步驟5)中更換培養(yǎng)液的具體方法是：每7-15天吸出半量的培養(yǎng)液，并同時換入半量新的細胞培養(yǎng)液。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述的細胞培養(yǎng)液是昆蟲細胞培養(yǎng)液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細胞培養(yǎng)液pH在6.2-6.6之間，其中細胞培養(yǎng)液中的青霉素與鏈霉素的總含量不超200U/mL；胎牛血清的體積容量占細胞培養(yǎng)液體積容量的5％一15％。

6.根據權利要求1所述的昆蟲細胞的構建方法，其特征在于：其中所述的昆蟲細胞培養(yǎng)液選自商品化的昆蟲細胞培養(yǎng)液TNM-FH，Grace’s，TC-100，IPL-41，或Ex-Cell?405。

7.根據權利要求1或2所述的昆蟲細胞的構建方法，其特征在于：對得到的昆蟲卵胚胎后一代傳代細胞進行凍存處理，以保存細胞的種子供使用時再復蘇。