[發明專利]一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白的凝膠層析復性方法

有效

• 申請號: 200810104966.4
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101386639A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 余蓉;高玲;蘇志國;張貴峰;梁蘭;陳凈;劉永東
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C07K1/16
• 分類號: C07K1/16;C07K1/14
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物制藥領域，具體地說是涉及一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的凝膠層析復性方法。

背景技術

本發明中的復性目標水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白，是通過一個(Gly)₃柔性肽基團首次將重組水蛭素HV3的C末端12肽與rPA基因融合而成的一種全新蛋白。

大腸桿菌表達體系因具有低廉性、高效性和穩定性等優點在科研生產中被廣泛應用。然而，重組蛋白在大腸桿菌中的高水平表達經常導致蛋白聚集而形成不溶的、無活性的包涵體。目前上市的重組蛋白藥物中，54％以大腸桿菌作為表達系統，而大腸桿菌表達蛋白中有一半形成包涵體。本研究所構建的水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白是通過大腸桿菌進行表達，以包涵體的形式存在。包涵體雖然由無活性的蛋白組成，但包涵體形成對于重組蛋白的生產也提供了幾個優勢：①以包涵體形式表達的蛋白質的濃度比較高，有時甚至可以達到細胞總蛋白含量的30％(S.Misawa，I.Kumagai.Biopolymers(peptide?science)，1999，51：297-307.)；②如果重組蛋白質以包涵體形式存在，由于包埋了酶攻擊的位點，可以最大限度地抵抗蛋白質酶的攻擊；③包涵體表達的蛋白質沒有活性，細胞破碎和以后的純化步驟，不用考慮蛋白質的失活問題；④包涵體形式表達的蛋白質與宿主細胞的其他蛋白質的分離比可溶蛋白質的分離方法簡便，造價低，使用簡單的離心或者過濾的手段就能使包涵體與宿主細胞的其他蛋白質成分進行有效的分離；⑤有些表達的外源蛋白質對細胞有毒性或者致死，大量表達時會導致細胞的死亡，最終的細胞數量和產物相當低，而包涵體形式的蛋白質由于喪失了生物活性從而可以高效大量地表達；⑥對于以包涵體形式表達的產物可以比較容易地進行在線的觀測定性。

包涵體蛋白質復性是生物工程下游技術中的一個重要問題。一個有效的、理想的折疊復性方法應具備以下幾個特點：①活性蛋白質的回收率高；②正確復性的產物易于與錯誤折疊蛋白質分離；③折疊復性后應得到濃度較高的蛋白質產品；④折疊復性方法易于放大；⑤復性過程耗時較少。就實際生產而言，要求折疊復性過程必須快速、低成本、高效。雖然蛋白質的折疊復性已有很多方法，但針對每一種蛋白質仍需通過實驗摸索出最佳的方法。由于蛋白質本身的復雜性和多樣性，蛋白質的復性方法也各不相同，本研究目標是對已采用第三代基因工程技術——蛋白質工程技術在分子水平上有目的設計構建的水蛭素12肽與瑞替普酶新型抗凝溶栓雙功能重組融合蛋白HV12p-rPA進行復性。對該具有9對二硫鍵的HV12p-rPA融合蛋白體外折疊復性具有相當的挑戰性和難度。由于融合蛋白的r-PA分子中18個Cys要形成9對二硫鍵，所以大腸桿菌表達HV12p-rPA時，因發生二硫鍵的錯配而形成致密的包涵體，溶解變性后要使其重新正確折疊和復性成活性狀態非常困難，這是由于組成九對二硫鍵的18個Cys在復性時錯誤配對造成的。

蛋白質復性技術是基因工程蛋白產生的重大共性關鍵技術，直接關系到生產成本和技術能否產業化，所以，研究基因工程蛋白的復性技術不但在理論上有重大意義而且也有重大的應用價值。蛋白的體外復性被認為是一項異常艱巨的任務，目前已存在的復性方法是很多的，較常見的除了稀釋復性以外，還有透析復性、柱上復性，但普遍復性率不高，只有20％左右的目的蛋白分子(汪家政等，蛋白質技術手冊，科學出版社，2001年，p31)得到正確的空間構型，獲得生物學活性。并且，變性蛋白的體外復性受外部環境的影響較大，不同蛋白的復性過程不同，特異的復性環境，包括緩沖液的組成、蛋白濃度、溫度、pH等應根據蛋白的不同而異。沒有哪種復性方法可以通用于所有的蛋白。近來，有人轉向于體內蛋白質折疊的模擬，產生了一些新的方法，例如將小分子伴侶固定化后，相當于親和層析的原理，復性蛋白質的同時使其濃縮和純化。有很大的應用前景，但是，由于這些分子伴侶均需要特別制備技術，對于大規模多種蛋白質制備，仍屬昂貴試劑。所以，要將實驗室的研究成果產業化，獲取實際的生產成果，就不得不考慮生產成本以及操作難易程度這兩個問題。因此，制約基因藥物生產的一個關鍵性難題就是復性效率、復性成本以及生產操作難易的問題。