[發(fā)明專利]一種蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體反浮選分離純化生產(chǎn)工藝

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810104712.2
• 申請(qǐng)日: 2008-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101260144A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 弓愛(ài)君;李紅梅;王子佳;曹艷秋;邱麗娜;蔣辰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京科技大學(xué);中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14;C12N1/20;C12R1/07
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了一種蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體反浮選分離純化生產(chǎn)工藝，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

背景技術(shù)

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是一種革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌。Bt的菌體為短桿狀，生鞭毛，單生或形成短鏈。當(dāng)菌體的營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)到一定的階段后，在菌體的一端形成芽孢，另一端形成一種被稱為伴孢晶體的近菱形的蛋白質(zhì)晶體，菌體破裂后可釋放出芽孢和伴孢晶體。

在Bt的基因工程、毒理學(xué)研究、殺蟲(chóng)機(jī)理、對(duì)人類的安全性等科學(xué)研究方面都對(duì)Bt伴孢晶體純品提出了極大的需求。因此，萃取法(中國(guó)專利99122189.3)、梯度密度離心法、液體雙相分離法、等電點(diǎn)沉淀法、堿裂解法、高速離心法和生物物理法等Bt伴孢晶體的分離純化方法逐步得到了發(fā)展(左雅慧，蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)條件及晶體蛋白提純方法初探，植物保護(hù)，1999，25(4)：32-34；郭艾英，蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白的制備方法，食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(8)：8-10；朱仕房，雙水相體系分離蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的研究，世界農(nóng)藥，2000，22(5)：39-42)。但是，萃取法使用了高毒性的有機(jī)溶劑CCl₄，不利于環(huán)境保護(hù)；梯度密度離心法提取蛋白量少，而且超離心時(shí)間很長(zhǎng)，約14h，成本高，操作復(fù)雜；液體雙相法體系復(fù)雜，影響因素多，難于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化；等電點(diǎn)法容易破壞了伴孢晶體的形態(tài)；堿裂解法很容易出現(xiàn)伴孢晶體被自身產(chǎn)生的堿性蛋白水解酶降解的現(xiàn)象；高速離心法提取的產(chǎn)品純度較低；生物物理法需要特種試劑，條件苛刻，成本過(guò)高。因此，Bt伴孢晶體仍處于實(shí)驗(yàn)室自制自用階段，尚無(wú)商品出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種Bt伴孢晶體反浮選分離純化生產(chǎn)工藝，采用增加一種Bt伴孢晶體反浮選分離純化方法，該方法的特點(diǎn)是工藝簡(jiǎn)單、易于操作、產(chǎn)品純度在99.99％以上、生產(chǎn)成本低、適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明采用浮選分離方法將Bt伴孢晶體與孢子、營(yíng)養(yǎng)體碎片等雜質(zhì)分離，獲得Bt伴孢晶體純品，生產(chǎn)工藝(流程參見(jiàn)附圖)如下：

按重量百分比稱取牛肉膏0.2～0.4％，蛋白胨0.6～1.5％，氯化鈉0.3～0.6％，瓊脂1.3～2.5％，水95～98％，用NaOH調(diào)pH＝7.4～7.6，100～130℃滅菌20～40分鐘，在潔凈工作臺(tái)中將滅菌后的液體倒入已滅過(guò)菌的大培養(yǎng)皿中，自然冷卻至室溫，液體凝固形成瓊脂固體培養(yǎng)基；用接種環(huán)沾取Bt菌種，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面接種，之后在生化培養(yǎng)箱中26～36℃培養(yǎng)36～48小時(shí)，此時(shí)，在瓊脂固體培養(yǎng)基表面上形成一層菌苔；用無(wú)菌純凈水將菌苔沖洗到容器中，得到無(wú)菌水菌苔懸濁液；用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理菌苔懸濁液10～30分鐘后，將此菌苔懸濁液注入微泡浮選柱中浮選；在此反浮選過(guò)程中，芽孢和營(yíng)養(yǎng)體碎片進(jìn)入泡沫層而脫離體系，伴孢晶體則留在液漿中，之后以7000～9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心液漿10～20min，棄去上清液，得到伴孢晶體半成品；洗滌伴孢晶體半成品，以7000～9000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心，得到含水的伴孢晶體，在-20～-80℃，0.1～1.0Pa真空度條件下干燥3～4小時(shí)，得到伴孢晶體純品。

所述在瓊脂固體培養(yǎng)基表面接種，是按“之”字形接種。

所述的浮選是將菌苔懸濁液逐步注入30～100L微泡浮選柱中，浮選的進(jìn)氣量為2～8L/min，浮選10～30分鐘。

所述的洗滌伴孢晶體半成品是用0.5～1.5M?NaCl生理鹽水洗滌伴孢晶體半成品3～5次，每次10～15L，再用無(wú)菌純凈水洗滌伴孢晶體半成品3～5次。

得到的伴孢晶體純品于-20～-80℃環(huán)境中保存。

本發(fā)明的特點(diǎn)在于：

(1)本工藝的核心步驟是反浮選分離伴孢晶體及雜質(zhì)。伴孢晶體是一種蛋白質(zhì)，分子量在65～130KD左右，在水中的溶解度很小，以粒狀形態(tài)存在。伴孢晶體由氨基酸組成，其表面存在大量的羧基和氨基，因此，伴孢晶體的潤(rùn)濕性良好，在反浮選過(guò)程中留在漿液中；

(2)芽孢和營(yíng)養(yǎng)體碎片的表面潤(rùn)濕性差，在反浮選過(guò)程中與氣泡、水形成三相體系，上升到泡沫層，能夠很好地與體系分離；

(3)在超聲波處理發(fā)酵物懸濁液的過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)體被擊碎，伴孢晶體從其中脫離出來(lái)，同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)體中的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)入漿液中。這些營(yíng)養(yǎng)液含有小分子量的蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)，是浮選過(guò)程中的發(fā)泡劑。因此，浮選過(guò)程中不需要外加發(fā)泡劑，這樣既降低了成本，又避免了雜質(zhì)的引入；