[發明專利]一種天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法

有效

• 申請號: 200810096874.6
• 申請日: 2008-05-08
• 公開（公告）號: CN101275149A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 田亞平;馬亞敏;劉琦
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P1/02
• 分類號: C12P1/02;C12R1/645
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1、一種天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，其特征為：采用云芝發酵，將云芝接入以馬鈴薯為主要成分的培養基中，用HCl調節pH，發酵培養，收集菌體，反復凍融與超聲波相結合將菌體細胞破碎，高速離心，離心上清液經過大孔樹脂脫色得到粗抑制劑，再通過DEAE52離子交換層析得純化的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，再經真空冷凍干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制劑干粉；其工藝為：

A云芝發酵：

(1)出發菌株：采用云芝(copious?versicolor)作為出發菌株，該菌株購自華中農業大學菌種實驗中心；

(2)種子培養基(W/V)：切絲加熱煮沸30min的新鮮馬鈴薯20％，葡萄糖2％，KH₂PO₄?0.3％，MgSO₄·7H₂O?0.15％，(NH₄)₂SO₄?0.2％，麩皮1％，pH自然，121℃滅菌30min；

培養條件：接入2～3粒黃豆粒大小的斜面菌塊，26℃、150r/min培養4～6天；

(3)發酵培養基組成(W/V)：糖2％，(NH₄)₂SO₄?0.2％，MgSO₄·7H₂O?0.15％，Na₂SO₃?0.05％，KH₂PO₄?0.3％，馬鈴薯汁40％，121℃滅菌20min；

發酵條件：發酵溫度為24～28℃，發酵時間5天，攪拌頻率為150～170r/min，起始pH為5.8～6.5，裝液量為75mL/250mL三角瓶，接種量為10％；

B提取并分離純化天冬氨酸蛋白酶抑制劑：

(1)反復凍融：將發酵液放入-20℃冰箱冷凍，取出后30℃水浴解凍，如此反復進行3次；

(2)超聲波破壁：超聲波功率280W、溫度20℃、處理量40mL進行細胞破碎10min，12000r/mim離心15min，收集上清細胞破碎液；

(3)大孔樹脂脫色：利用大孔樹脂D101對上清細胞破碎液進行脫色；

(4)離子交換層析：DEAE52離子交換纖維素色譜柱規格為15cm×2.2cm，平衡緩沖液為20mmol/L、pH7.0的磷酸鈉緩沖液，洗脫模式：以平衡緩沖液洗脫2倍柱體積后，再以添加0.1mol/L?NaCl的磷酸鈉緩沖液進行洗脫，流速為0.8～1.2mL/min，280nm波長紫外檢測；

(5)干燥成粉：采用真空冷凍干燥機將DEAE52離子交換層析0.1mol/LNaCl的磷酸鈉緩沖液梯度下收集的峰液脫鹽后干燥成粉，即為純化的天冬氨酸蛋白酶抑制劑凍干粉。

2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述及的糖為葡萄糖。