[發明專利]檢測受試者體液內疾病相關蛋白聚合能力的方法

無效

• 申請號: 200810096107.5
• 申請日: 2008-04-29
• 公開（公告）號: CN101308144A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發明（設計）人: 于順;陳彪;李雁;李堯華
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學宣武醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N21/27
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 李丙林

1.一種體外檢測受試者體液促進疾病相關蛋白聚合能力的方法，所述方法包括：

a.提供來自受試者的體液樣本；

b.制備所述疾病相關蛋白的寡聚體，其通過將純化的重組人疾病相關蛋白與所述體液樣本在一定溫度條件下進行振蕩孵育，使所述疾病相關蛋白聚合而制得；其中所述重組人疾病相關蛋白通過重組質粒原核或真核表達制備，并進行純化，最后冷凍抽干保存；

c.檢測所述疾病相關蛋白的寡聚體，其中檢測孵育后的所述體液樣本中的所述疾病相關蛋白寡聚體的含量。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述疾病相關蛋白是α-突觸核蛋白。

3.根據權利要求2所述的方法，其中檢測α-突觸核蛋白寡聚體的方法是ELISA方法。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述體液樣本是受試者的血清、血漿或腦脊液，其量為10～100μL。

5.根據權利要求3所述的方法，其中，所述α-突觸核蛋白寡聚體的制備過程包括將體液樣本用PBS或生理鹽水稀釋；接著加入所述重組人α-突觸核蛋白，過濾除菌；然后振蕩孵育。

6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述體液樣本用所述PBS或生理鹽水稀釋0～10倍。

7.根據權利要求5所述的方法，其中，所述振蕩孵育的溫度為約20～40℃、頻率為約100～1000rpm、時間為約6～72小時。

8.根據權利要求5所述的方法，進一步包括在所述振蕩孵育后將所得反應液用所述PBS溶液稀釋100～200倍。

9.根據權利要求3所述的方法，其中，所述ELISA方法檢測所述α-突觸核蛋白寡聚體的步驟包括：

a.包被：用NaHCO₃緩沖液稀釋非生物素化的3D5抗α-突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度為約0.1～2.0μg/mL，向酶標板各孔加入所述抗體稀釋液，孵育過夜，用PBST沖洗所述酶標板各孔；

b.封閉：向酶標板各孔加入50～200μL封閉液，在35～40℃孵育1～5小時后，用PBST沖洗所述酶標板各孔，然后向酶標板各孔加入經稀釋的所述α-突觸核蛋白寡聚體樣品，在35～40℃孵育1～5小時后，用所述PBST沖洗所述酶標板各孔；

c.用所述封閉液稀釋生物素化的3D5單克隆抗體至終濃度為約0.1～2μg/mL，向酶標板各孔加入該抗體稀釋液，在35～40℃孵育1～5小時，用所述PBST沖洗酶標板各孔；

d.用所述封閉液稀釋親和素標記的堿性磷酸酶，向酶標板各孔加入所述抗體稀釋液，在35～40℃孵育0.5～2小時，用所述PBST沖洗所述酶標板各孔；

e.向酶標板各孔加入pNPP，并室溫顯色10～50分鐘；

f.在405nm處測定酶標板各孔的吸光度值。

10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法在檢測與帕金森病相關的α-突觸核蛋白聚合能力中的應用。

11.根據權利要求1-9中任一項所述的方法在檢測路易體癡呆、阿爾茲海默病人或其他蛋白變性病血液和腦脊液對相關蛋白或多肽聚合能力中的應用。