[發明專利]固定化蛋白酶及其在制備乳酪蛋白肽中的應用方法

無效

• 申請號: 200810094030.8
• 申請日: 2008-04-28
• 公開（公告）號: CN101260397A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發明（設計）人: 周利根;郜海燕;陳新峰;王君虹
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12N11/04
• 分類號: C12N11/04;C12P21/06
• 代理公司: 北京一格知識產權代理事務所
• 代理人: 鐘廷良;夏繼光

技術領域

本發明涉及一種固定化酶及其應用，尤其涉及一種固定化蛋白酶，本發明還涉及該固定化蛋白酶在制備乳酪蛋白肽中的應用，屬于食品生物技術領域。

背景技術

功能性食品是二十一世紀食品工業發展的重點。開發各種具有生理活性的功能營養因子，具有深遠的生物學意義和重要的應用價值，也是當今國內外食品界最熱門的研究課題和極具發展前景的產業。

乳中含有大量不同活性的生物活性肽，這些肽或自然存在于乳中或源于乳蛋白水解后的產物。由于其分子量較小，在小腸內以完整肽段的形式被人體吸收，不會引起人體的免疫排斥反應，且具有多種特殊的生理活性功能。

乳酪蛋白經蛋白酶水解得到小分子乳酪蛋白肽，乳酪蛋白肽主要是由2～7個氨基酸組成的多肽混合物，是一種多功能營養因子，具有免疫調節、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抗菌等多種生理活性功能，可廣泛應用于食品和醫藥等行業，可制成天然降血壓藥、患者營養補劑、嬰幼兒食品、老年食品、運動食品和各種功能健康食品等。

乳源生物活性肽，因其源于天然食物蛋白以及多種特殊的生理活性功能，已成為發達國家的研究熱點。經過近20年的探索，到目前為止，已經發現了多種乳源生物活性肽。國外對乳蛋白來源的ACE抑制肽研究有一定的報道，尤其是日本對來源于乳清蛋白、酪蛋白和酸奶中的ACE抑制肽進行了較多的研究，取得了較大的進展。目前國內對此方面的研究才剛剛起步，國內數所高校進行了乳源生物活性肽的研究，在蛋白酶的選擇，酶解工藝等方面取得了一定的進展。但目前只有極少數的生物活性肽能夠進行規模化生產，如CPPs。對于大多數乳蛋白來源的活性肽來說，其工業化生產還有一定的難度，主要是因為這些生物活性肽在乳蛋白酶解液中的含量低，分離和提純難度大，檢測手段和技術不夠成熟，這些都是阻礙乳蛋白源生物活性肽產業化的主要因素，也是今后研究工作的重點所在。

目前國內已有蛋白酶水解乳酪蛋白制取乳酪蛋白肽的研究，但關于固定化酶水解制備乳酪蛋白肽的研究尚未見報道。

發明內容

本發明目的之一是提供一種固定化蛋白酶。

本發明目的之二是將該固定化蛋白酶應用于制備乳酪蛋白肽。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

一種固定化蛋白酶，主要按照以下方法制備得到：

(1)將濃度為0.5～10％的殼聚糖酸性溶膠，攪拌，使溶膠液滴均勻分散，滴入體積分數為2.5％的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(按體積分數計)達到0.2-3％，攪拌加入0.5-3mol/L?NaOH溶液，至NaOH溶液的終濃度(按體積分數計)為0.05％～3％，于40-70℃保溫反應0.5-5h，靜置冷卻后棄去上層，依次用丙酮、無水乙醇抽洗，最后用蒸餾水沖洗，真空干燥，得到固定化載體殼聚糖微球，備用；

(2)向0.1％～5％的蛋白酶溶液中加入步驟(1)所制備的固定化載體殼聚糖微球，其中，蛋白酶溶液與固定化載體殼聚糖微球按1-4∶1的重量比進行配比；置于搖瓶器中振蕩吸附2-30h，然后滴入體積分數為2.5％戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最終濃度(按體積分數計)達到0.2-3％，交聯0.2-10h，得到固定化蛋白酶。

其中，所述的蛋白酶優選自木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、動物蛋白水解酶、堿性蛋白酶或胃蛋白酶中的任意一種或一種以上按任意比例所組成的復合酶。

根據需要，將本發明所制備得到的固定化蛋白酶裝入或填充入合適的柱中(作為參考，柱子材質可以為玻璃、工程塑料或不銹鋼等材料，直徑可以為Φ50mm，長度可以為1200mm，裝填系數可以為85-90％等；當然，本領域技術技術人員可根據需要將上述參數作相應的修改)，得到固定化蛋白酶柱，可將其應用于制備乳酪蛋白肽。

作為一種優選的方法，一種將上述固定化蛋白酶柱應用于制備乳酪蛋白肽的方法，包括以下步驟：(1)預處理乳酪蛋白溶液；(2)將經過預處理的乳酪蛋白溶液過固定化蛋白酶柱，進行酶水解反應；(3)收集酶水解液，離心分離，得上清液；(4)將上清液脫色處理后再進行脫鹽處理；(5)將脫鹽處理后的酶解液進行納濾處理；(6)濃縮；(7)濃縮后的產物包埋于壁材中；(8)噴霧干燥，即得乳酪蛋白肽。

為了達到更好的技術效果，步驟(1)中所述的預處理優選為：將乳酪蛋白配制成濃度為1.0-6.0mg/mL的溶液在60-100℃溫度條件下預熱處理5-20min；然后將乳酪蛋白溶液冷卻至30-60℃；