[發明專利]一種培育高含量甜葉菊糖苷遺傳材料的方法

無效

• 申請號: 200810092671.X
• 申請日: 2008-04-21
• 公開（公告）號: CN101258834A
• 公開（公告）日: 2008-09-10
• 發明（設計）人: 王貴民;郝再彬;董振紅
• 申請（專利權）人: 桂林工學院
• 主分類號: A01H1/04
• 分類號: A01H1/04;A01H1/02;A01H4/00;G01N33/48;G01N30/00;C12N5/04
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技術領域

本發明涉及一種培育高含量甜葉菊糖苷遺傳材料的方法。

背景技術

蔗糖等可以被正常人攝取、吸收、轉化。過量的蔗糖導致糖尿病患者血糖上升，引起糖尿病并發癥，甚至危及到生命安全。

目前糖尿病患者的數量呈逐年增加的趨勢，另外正常人過量攝取可吸收性糖也不利于身體健康，為此具有與蔗糖口感相近，同時為非吸收性、無能量代謝的甜味劑--天然糖的開發利用就成為今后的發展方向。甜葉菊糖苷在人體內基本上以原體排出，不會分解而產生葡萄糖，是一種極低熱量的甜味劑。隨著人們生活水平的不斷提高，越來越傾向于使用天然植物無能量甜味劑是勢在必行。在世界上許可添加的幾大類甜味劑中，一半來自化工合成，如：糖精、甜蜜素等；另一半來自于天然植物，如：蔗糖、羅漢果糖苷等。

在天然植物無能量甜味劑中甜度比較高的就有甜葉菊植物，其糖作為甜味劑應用也是近十幾年的事，而且應用范圍越來越廣泛。由于其甜度高、無能量等特性而被廣泛地應用于食品、保健品、藥品、化妝品、抗氧化食品、飼料添加劑等行業。

甜葉菊植物中有幾種甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(英文：Stevioside)和450倍的RA(英文：Rebaudioside?A，或稱為甜葉菊A₃，英文：Stevioside?A₃)。獲得高含量甜葉菊糖苷的品種，就可以降低工業化加工生產成本，提高收率，增加效益。

發明內容

本發明的目的就是提供一種培育高含量甜葉菊糖苷遺傳材料的方法，即利用本發明創建一個甜葉菊糖苷高含量的種質資源品系。

本發明具體步驟為：

(1)根據“節數平均24節，葉片大、莖桿粗壯、生長迅速、適應性強”的原則對單株植株進行初步篩選；

(2)將初選植株的葉片使用直徑0.5～1.5cm打孔器打孔，避開葉片的主脈打取1～10片，重量0.5±0.005克；將葉片破碎后，采用下列測定糖苷的試劑組成進行一般性測定。將200g酒石酸鉀鈉，10～30g氫氧化鈉溶于0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸3～9g、結晶酚3～9g、亞硫酸鈉3～9g，先后于溶液中溶解；最后再加入鐵氰化鉀0.1～0.5g使其溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1L所得到的溶液；

在上述的一般性測定數據結果中優選出優良單株，優良單株占單株的0.1％～10％，利用高效液相色譜儀對優良單株葉片中的甜葉菊糖苷做進一步分析；

(3)初步獲得幾個甜葉菊糖苷含量較高的優良植株，以這些植株為材料進行組織培養擴繁，甜葉菊再生體系的外植體為無菌苗的莖尖，培養基如下：

愈傷組織形成的培養基：MS+6-BA?0.6mg/L+NAA?0.25mg/L；

不定芽分化的培養基：MS+6-BA?1mg/L+瓊脂6g/L+蔗糖30g/L；

不定芽繼代培養基：MS+6-BA?0.5mg/L+NAA?0.05mg/L+瓊脂6g/L+蔗糖30g/L；

不定芽生根培養基1/4MS+IBA?0.1mg/L+NAA?0.1mg/L；

MS：植物組織培養中常用的完全營養培養基，6-BA：6芐基嘌呤；NAA：萘乙酸；IBA：丁基嘌呤；

(4)將組培苗移植到大田種植，經高效液相色譜儀檢測進一步分析；

(5)將所得的品系自交，經過遺傳方法分析，獲得純合體植株。

本方法的開發原理：針對甜葉菊糖苷含量進行。分三次實施：組織培養前、組織培養后以及收獲第一代種子。如下：

由于甜葉菊是異花授粉，長期以來嚴重退化，群體的形態、糖苷含量、生長速度等明顯雜合。我們以糖苷含量6～11％的甜葉菊植物活體為材料，采用下列測定糖苷的試劑組成進行一般性含量測定。通過測定獲得高糖苷含量的植株；再通過組織培養，獲得群體，高效液相色譜儀檢測進一步檢驗糖苷含量，自交獲得純合體植株，收獲種子。

從該材料群體中測定植株的相同葉位做第一次單株選育，選出糖苷含量高的單株進行組織培養。將組組織培養苗移栽定植到大田后再進行定株定葉位測定糖苷含量，測定方法同前，作為第二次單株選育。再進一步選出糖苷含量高的單株進行扦插、無性繁殖；成株后進行第三次單株選育，測定方法同前。干葉總糖苷含量大于13％±2％，通過有性繁殖收獲種子，這是組織培養后的第一代種子，從而得到甜葉菊新種質資源品系。該甜葉菊種質資源品系是生產高糖苷含量的原料，糖苷含量從6～11％提高到13％±2％。

本發明的方法可以應用如下：