[發明專利]病原體原發感染的檢測

有效

• 申請號: 200810091588.0
• 申請日: 2008-04-21
• 公開（公告）號: CN101289513A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發明（設計）人: C·肖爾茨;P·沙斯米特;U·斯米特;E·法茨
• 申請（專利權）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;G01N33/53
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 權陸軍;黃可峻

技術領域

本發明涉及適合用作病原體感染、尤其病原體原發感染的檢測中的試驗抗原的融合多肽。另外，本發明涉及用于檢測和差別化測定由病原體感染產生的IgM抗體的方法。此外，提供了用于實現這些方法的試驗試劑。

背景技術

除了PCR技術以外，免疫試驗仍然在感染血清學中起重要作用。通過不同免疫球蛋白類別的特異性測定，免疫學使得分析疾病的病期成為可能。通過測定針對某些病毒抗原的IgM和IgG效價，可能區分不同的感染階段，例如急性感染、復發性感染、慢性/持續感染或感染后疾病病期。例如，針對病毒糖蛋白的IgG分子僅僅在巨細胞病毒感染的晚期產生(Schoppel等JID(1997)175，533-544；Eggers等，J.Med.Virol.(2001)63，135-142)。

在有各個其它免疫球蛋白類別存在下可靠地特異性檢測IgG和IgM的重要方面是，檢測抗原的有效表位濃度或有效表位密度。高度有效的表位濃度是指，存在高表位密度，且所有表位都可用于抗體結合。與此相反，多肽聚集體也具有高表位濃度，但是有效表位濃度低，因為表位部分地或完全地被掩蓋或隱藏，且因而不可用于抗體結合。高表位濃度是特異性IgM識別的前提，而低表位濃度是特異性IgG識別的前提。在應檢測針對抗原A的IgM分子的經典夾心IgM試驗中，將多聚體抗原A用作固定化的捕獲抗原。攜帶報道基團的相同多聚體抗原A用作檢測抗原。IgM分析物結合捕獲抗原和檢測抗原，從而將報道基團固定化在固相(例如包被鏈霉抗生物素蛋白的珠子)上。為了避免針對A的IgG分子的干擾，向試驗中加入未標記的單體抗原A，作為干擾消除劑(WO98/23955，US 6,489,129 B1)。相應地，特異性的IgG夾心試驗(WO98/23961，US 6,645,732 B1)可以包含用于檢測IgG的單體抗原和避免用IgM干擾的未標記的多聚體抗原。

允許IgM和IgG分子的特異性檢測的原理基于它們各自的分子結 構。五聚體IgM具有10個相同的抗原結合互補位，而單體IgG每個分子僅具有2個結合部位。IgG的檢測基于對分析物的親和力，而IgM的檢測基于親合力(avidity)。在第一種情況下，通過表位和互補位(即IgG抗原結合部位)之間的高親和力相互作用來實現結合；在后一種情況下，通過幾種低親和力相互作用的協同增強來實現結合(親合力是指，單個解離常數不是相加，而是相乘，即k_D約10^-5M的相對弱的相互作用被2個獨立的結合事件增加，以產生k_D約10^-10M的高親和力相互作用)。因而，可以說作為經驗法則，單體抗原用于檢測IgG，而寡聚體/多聚體抗原用于檢測IgM。

通過同或異雙功能交聯劑化學交聯單體抗原，可以實現抗原寡聚化或多聚化。通常，可以通過調節反應條件(蛋白和交聯劑的濃度、pH、溫度、攪拌速率、反應時間)來最優化寡聚化或多聚化，這是非常耗時和費力的。盡管如此，在不同批次中可能得到不同的交聯度，這需要隨后的分級分離和/或校準程序。此外，更高的交聯度經常導致溶解度的降低，這可能導致試驗性能的問題。因而，需要發現改良的以確定的且可再現的方式提供多聚體抗原的方法。

美國專利6,207,420描述了一種融合序列，其包含與靶異源肽或蛋白融合的具有至少90％預測的溶解度可能性的載體蛋白，包括大腸桿菌(E.coli)蛋白。優選地，異源肽或蛋白在細菌中表達時，通常不溶。

WO 03/000878描述了一種融合蛋白，其包含至少一個靶多肽和位于其上游的至少一個FKBP蛋白伴侶，所述FKBP蛋白伴侶選自：FkpA、SlyD和觸發因子。靶多肽可以是哺乳動物基因產物或哺乳動物病原體基因產物。

發明內容

本發明的第一個方面涉及融合多肽，其包含

(i)至少一個多聚化結構域，和

(ii)來自病原體的表位區段的多個拷貝。

所述融合多肽分子能形成多聚體。多聚體包含多個經由多聚化結構域通過非共價相互作用結合到一起的單體亞基。多聚體可以通過例如在合適條件下溫育融合多肽分子來形成。