[發(fā)明專利]一種利用糞便中SFRP2基因超甲基化篩查大腸癌的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810089594.2
• 申請日: 2008-04-09
• 公開（公告）號: CN101250588A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王道榮;湯東
• 申請（專利權(quán)）人: 王道榮;湯東
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學領(lǐng)域，特別是公開一種篩查大腸癌的方法。

背景技術(shù)

大腸癌是指大腸粘膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變，包括結(jié)腸癌、直腸癌和肛管癌，是最常見的消化道惡性腫瘤之一。臨床常見血便或粘液膿血便，大便形狀或習慣發(fā)生改變，腹痛，腹部包塊等。根據(jù)其發(fā)生部位不同，其臨床表現(xiàn)常各有其特殊性。大腸癌起病隱匿，早期常無明顯的臨床表現(xiàn)，病情發(fā)展較慢，所以在早期易被忽略。大腸癌的危險因素包括：①年齡超過45歲，發(fā)病高峰為45-65歲；②腺瘤性息肉，包括管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、管狀-絨毛狀腺瘤(混合性腺瘤)，絨毛結(jié)構(gòu)比例高的息肉和大的息肉更可能癌變，大腸癌生成可能需10年時間，從可辨認的腺瘤發(fā)展為侵襲性癌需5年；③大腸癌家族史，癌病人一級親屬的大腸癌發(fā)病率比普通人群高出2～3倍，而家族性腺瘤性息肉病病人大腸內(nèi)有成百上千個腺瘤性息肉，如不切除結(jié)腸，在十年內(nèi)很可能發(fā)展為癌；④炎癥性腸病，潰瘍性結(jié)腸炎或Crohn病癌變機會隨病程而增大。

隨著社會的發(fā)展，大腸癌的誘發(fā)因素不斷增加，尤其是近二十年來，其發(fā)病率居高不下并有明顯的上升趨勢。在我國，大腸癌的發(fā)病率位居腫瘤的第五位，發(fā)病男性多于女性。據(jù)國內(nèi)統(tǒng)計，該病發(fā)病年齡也呈年輕化，高發(fā)國家大腸癌高發(fā)年齡為60～70歲，30歲以下者占6％左右，而我國大腸癌好發(fā)年齡比國外提早10～15歲，30歲以下者占10％左右，我國報道的最小的患者14歲。

大腸癌的預(yù)后與確診時腫瘤的分期關(guān)系最密切，病期晚則預(yù)后差。大腸癌患者如無轉(zhuǎn)移，手術(shù)5年存活率可超過90％；如有轉(zhuǎn)移，手術(shù)5年存活率不足50％。大腸癌早期患者無特異性臨床癥狀，極易被忽略而延誤治療，因此，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療成為治療大腸癌的關(guān)鍵因素。目前臨床常用的檢測方法有以下幾種：1.直腸肛門指檢，該方法簡單易行，是直腸癌術(shù)前檢查中最基本的方法，但是此方法容易誤診、漏診，特異性不強。2.實驗室抽血檢查。針對性不強，且對身體有損傷，不適合作為普查或早期診斷方法。3.內(nèi)鏡檢查。4.CT診斷。5.超聲顯象檢查。6.磁共振檢查。這些方式或?qū)ι眢w都有一定的創(chuàng)傷性，對身體造成損傷，或特異性不強，或費用太高，因此，探索一種安全可靠、特異性強、能早期有效篩查大腸癌的方法，使患者能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療大腸癌，成為醫(yī)學界噬待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上問題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用糞便中SFRP2基因超甲基化篩查大腸癌的方法。

為了達到以上目的，本發(fā)明是通過以下步驟實現(xiàn)的：

1、標本制備，糞便DNA從糞便標本用QIAamp?DNA?Stool?Mini?Kit分離DNA，置于-70--85℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2、數(shù)據(jù)收集，取500ng-2μg的基因組DNA放在容器中，用終濃度為0.15-0.25mol/L的NaOH在36-37.5℃中變性14-17分鐘，添加30μL的9-11mmol/L的對苯二酚和520μL的2.0-3.5mol/L的NaHSO₃，pH4.9-5.1，混合物在50-60℃下培養(yǎng)15-18小時，重亞硫酸鹽修飾的DNA用Wizard?DNA?Cleanup?kit純化，DNA用NaOH在室溫下培養(yǎng)14-17分鐘脫磺酸基，終濃度為0.25-.035mol/L，用醋酸氨中和，PH為6.5-7.3，終濃度為0.3mol/L，DNA用乙醇沉淀回收，用蒸餾水稀釋到終濃度為4.5-5.5ng/μL，3μL的重亞硫酸鹽修飾的DNA和從80μL提取出的等量的DNA用來擴增，PCR在反應(yīng)容器中進行，包括17.875μL的ddH2O、2.5μL的10×PCR?Buffer、2μL的dNTP?Mixture、0.25μL的Forward?Primer、0.25μL的Reverse?Primer、2μL的Template和0.125μL的TaKaRa?Taq?HS，在以下條件下進行：93-97℃變性5分鐘進入循環(huán)，循環(huán)溫度及時間為93-97℃，25-35秒；退火溫度：U型引物45-55℃，M型引物60-64℃，25-30秒；70-75℃，25-35秒，共40個循環(huán)，70-75℃延長5分鐘；

3、數(shù)據(jù)處理及檢測，進行電泳分析，根據(jù)電泳圖，得出甲基化結(jié)果，根據(jù)MSP原理判定有無腫瘤存在。