[發明專利]用于吸附、分離、檢測超微量靶蛋白的系統及其用途

有效

• 申請號: 200810089486.5
• 申請日: 2008-04-03
• 公開（公告）號: CN101246178A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 于中連;馬慶偉;趙洪斌;呂芳;呂萍萍
• 申請（專利權）人: 毅新興業（北京）科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N30/00;B01D15/08;B01J20/281
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技術領域

本發明涉及到蛋白組學和分子生物學中生物液體樣品中超微量靶蛋白的分離，具體是提供用于分離、檢測生物液體中超微量靶蛋白的系統及其使用方法。

技術背景

隨著生命科學的研究迅速進展，生物樣品中靶蛋白的分離方法日益受到科研工作者的關注。科學家們發現，隨著蛋白的檢測很多很靈敏準確的方法，如熒光定量PCR儀、質譜儀等的出現，目前限制蛋白質研究的問題是如何有效處理前期樣品。

目前也有很多處理生物樣品中靶蛋白的方法。其中最常見的是層析洗脫分離法(色譜法)，例如離子交換層析、選擇吸附層析(如疏水作用層析、親水作用層析、糖基化作用層析、dextran作用層析、脂肪酸作用層析)、親和作用層析(如生物素親和作用層析、免疫作用層析、凝集素作用層析、金屬鰲合/配位作用層析、配體或受體作用層析、共價作用層析)等。然而這些方法也有著很多缺陷限制其使用，如整個流程耗時很長、操作復雜(例如經過上樣、吸附結合、洗滌、洗脫、濃縮純化)、需要具有經驗的操作人員和復雜的儀器設備、操作前對樣品要求很高(樣品純度、不能有顆粒物等)。尤其是面對臨床診斷，要求操作簡單且并不需要完全分離生物樣品(例如分離血樣中的磷酸化蛋白、糖蛋白等)。

此外，近年來出現了用于分離微量蛋白的微珠芯片。蛋白質微珠芯片是指以生物分子微珠作為配基，將其固定在固相載體的表面，形成的蛋白質微陣列。常見的微珠有PVDF微珠，聚丙烯酰氨凝膠微珠、硝化纖維素膜微珠、聚苯乙烯微珠等等。然而這類微珠芯片有其固有的缺點：1、芯片特異性問題，這與芯片微珠表面修飾和修飾物都有關系，芯片微珠表面修飾工藝不好或者修飾物間隔不合適都可能造成芯片微珠表面的非特異性吸附，修飾物的特異性更是直接決定著芯片的特異性。2、芯片容量，芯片微珠的表面積有限，因此所修飾的修飾物數量是一定的，因此，芯片容量也一直是微珠芯片的一個重要問題。3、是芯片微珠同樣品的結合不充分，芯片微珠同待檢分子的結合屬于平面結合，并且芯片微珠所需樣品量很小，因此不能保證芯片微珠同樣品充分結合，這不像液體中兩項能充分混合；4、芯片微珠洗脫不充分，芯片是一個固體平面，洗脫不能完全洗滌微珠，可能造成干擾物質洗滌不完全從而影響芯片微珠的特異性；5、修飾樣品量小，對低豐度目標物質的檢測能力有限。

因此，需要提供一種特異性高、操作方便、省時省力、集吸附、分離、洗脫于一體的分離微量靶蛋白的系統及其使用方法。

發明內容

本發明針對蛋白的分離純化過程中所存在的問題，通過綜合層析洗脫分離法和蛋白微珠芯片法的優點，創造性發明了用于結合、分離、純化靶蛋白的系統及其使用方法。

該發明思路在于將蛋白微珠芯片中的微珠粒子，應用于層析洗脫分離領域，即將其作為層析分離柱中的載體，并將常規的層析分離柱環境創造性改變成類似于移液器槍頭(tip頭)環境，從而獲得能在同一環境中進行上樣、吸附、洗滌、洗脫、濃縮、鑒定同時還具有蛋白微珠芯片高特異性的應用效果.

因此，本發明第一個目的是提供一種用于吸附、分離、純化、檢測微量靶蛋白的系統。該系統包括：

(1)分離填料；和

(2)用于固定分離填料并使其與溶液結合以及吸取溶液的中空管；

(3)如果需要，分離填料上下面含有用于固定分離填料的支撐網；

其中所述的分離填料是直徑約在10-10³μm級或10-10³nm級的微珠組成，該微珠具有生理性無毒、生物高相容性的高分子材料內層和可逆結合或釋放靶蛋白的官能團外層。

在一個具體實施方案中，所述的中空管上端孔直徑大于下端孔直徑，上端孔同移液器前端吻合，分離填料被固定在中空管的中部或下部，通過移液器的吸取作用從下端孔吸入溶液并接觸分離填料。

在另一個具體實施方案中，中空管可以類似于移液槍的槍頭。

在另一個具體實施方案中，還可包括用于活化分離填料微珠的活化緩沖液。

在另一個具體實施方案中，用于制備所述的中空管和/或支撐網的材料是無機或有機惰性材料。其中惰性材料選自木質、紙質、塑料、玻璃、金屬、礦物質。

在另一個具體實施方案中，根據特殊修飾類型選擇現有的結合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液、活化緩沖液，例如用于離子交換修飾、選擇吸附修飾、親和作用修飾中所用的各種已知的結合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液、活化緩沖液。