[發明專利]基因工程藥物乙肝疫苗抗體芯片的制備方法

無效

• 申請號: 200810088966.X
• 申請日: 2008-04-10
• 公開（公告）號: CN101556286A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 李彬;梁倩;張銳
• 申請（專利權）人: 李彬;梁倩;張銳
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/576
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別是指一種基因工程藥物乙肝疫苗抗體芯片的制備方法

背景技術

本項目主要在基因工程藥物領域創立抗體芯片檢測技術平臺，自主研發抗乙肝疫苗抗體芯片檢測試劑盒(抗體芯片)完全是由中國人自主開發，應用這一芯片，可通過多種方式、多種渠道、多測面檢測乙肝疫苗制品的效價和含量，將檢測靈敏度由ug提高到ng級，從而達到更準確、更全面的效果，其檢測結果即可定性也可定量。抗乙肝疫苗抗體芯片檢測試劑盒(抗體芯片)對促進我國生物高技術前沿領域的發展具有重大鼓舞作用，對提升我國生物芯片技術、產品和市場的國際競爭力具有重大意義，此方法完全符合分子免疫學原理。目前國外幾乎所有的主要制藥公司都不同程度地采用了生物芯片技術來尋找藥物靶標，查檢藥物的毒性或副作用及進行藥物產品的定量和定性。用芯片技術進行大規模的藥物篩選可以省略大量的動物試驗，縮短藥物篩選所用時間，從而帶動創新藥物的研究和開發。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基因工程藥物乙肝疫苗抗體芯片的制備方法。

本發明的整體技術構思是：利用細胞融合、亞克隆及酶聯免疫吸附實驗進行特異性篩選技術，獲得高效價、高特異性抗人基因工程藥物乙肝疫苗單克隆抗體，由于此單抗效價高、特異性好，可直接應用于芯片的點樣，結合CY3標記的基因工程藥物乙肝疫苗與被檢產品建立抗體芯片競爭抑制法檢測基因工程乙肝疫苗含量的方法。抗體芯片競爭抑制法檢測基因工程乙肝疫苗含量具有靈敏度高，特異性好、操作簡單、高通量等優點，可用于生產線的監測和質控。

基因工程藥物乙肝疫苗抗體芯片的制備方法，它包括如下工藝步驟：

(1)動物免疫：將高純度的人基因工程藥物乙肝疫苗1ml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度人神經巢蛋白，用酶聯免疫吸附實驗方法測定其抗血清；

(2)分離脾細胞：取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后的Sp2/0細胞調整為細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞并制成細胞懸液；

(3)細胞融合：將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞懸液按1∶10比例混合，30秒內逐漸加入45％PEG(分子量：4000)，靜止90秒，使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中滴加培養液，以HAT選擇培養基進行細胞培養；

(4)篩選雜交瘤細胞：待融合的細胞培養至第七天時，吸取96孔培養板的孔中出現克隆細胞簇的培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，經有限稀釋進行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞擴大培養，選高效價，高特異性的細胞株再擴大培養并凍存；

(5)單克隆抗體純化保存：選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時收集，1.44(吸光單位)濃度為1mg/ml。

(6)將基因工程乙肝疫苗進行CY3標記

(7)基因工程藥物乙肝疫苗微陣列點樣：一張芯片點100個點，檢測線性范圍0.01～10ng/ml。

本發明的具體工藝步驟和各步驟中的工藝參數是：

步驟(1)將基因工程藥物乙肝疫苗1ml加等量的完全福氏佐劑并經充分乳化，與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～12周，每只腹腔注射0.2ml，間隔2周注射一次；采用酶聯免疫吸附實驗方法測定抗血清。

步驟(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細胞，鋪植96孔培養板，將換液后15小時的Sp2/0細胞調整為9×10⁵/ml細胞懸液，分離免疫的小鼠脾細胞。

步驟(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤細胞與脾細胞的比值按1∶10的比例混合，加入PEG使細胞彼此融合，在兩種細胞的混合細胞懸液中，第1分鐘滴加4.5ml培養液；間隔2分鐘滴加5ml培養液，然后加培養液50ml，以HAT選擇培養基按36％的孔為1個細胞/孔進行細胞培養。

步驟(4)中是將細胞培養至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養上清用酶聯免疫吸附實驗方法檢測抗體含量，依抗體的分泌情況篩選出高效價的抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。