[發(fā)明專利]基因工程藥物乙肝疫苗抗體芯片的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810088966.X
• 申請(qǐng)日: 2008-04-10
• 公開（公告）號(hào): CN101556286A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李彬;梁倩;張銳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李彬;梁倩;張銳
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/576
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1、基因工程藥物乙肝疫苗抗體芯片的制備方法，其特征在于它包括如下工藝步驟：

(1)動(dòng)物免疫：將高純度的人基因工程藥物乙肝疫苗1-10ml充分乳化，免疫與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高純度人基因工程藥物乙肝疫苗，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其抗血清；

(2)分離脾細(xì)胞：取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，鋪植96孔培養(yǎng)板，將換液后的Sp2/0細(xì)胞調(diào)整為細(xì)胞懸液，分離免疫的小鼠脾細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液；

(3)細(xì)胞融合：將具有較高活性Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞懸液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美國Sigma公司出品)使細(xì)胞彼此融合，在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中滴加培養(yǎng)液，以HAT選擇性培養(yǎng)基(美國海克隆公司出品)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

(4)篩選雜交瘤細(xì)胞：待融合的細(xì)胞培養(yǎng)至第5-10天時(shí)，吸取96孔培養(yǎng)板的孔中出現(xiàn)克隆細(xì)胞簇的培養(yǎng)上清用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)抗體含量，經(jīng)有限稀釋進(jìn)行三次亞克隆篩選，依抗體的分泌情況篩選出高效價(jià)的抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，然后進(jìn)行抗原特異性免疫組織化學(xué)原位測(cè)定，選高效價(jià)，高特異性的細(xì)胞株再擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存；

(5)單克隆抗體特異性篩選：選經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)大于1∶10000的陽性孔的上清，與多廠家、多批次的基因工程藥物乙肝疫苗進(jìn)行特異性和效價(jià)篩選。

(6)單克隆抗體純化保存：選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白純化儀(美國通用公司制造)將小鼠IgG單克隆抗體腹水溶液在A280nm時(shí)收集，1.44(吸光單位)濃度為1-10mg/ml。

(7)CY3標(biāo)記基因工程藥物乙肝疫苗：用CyDye?DIGE?Fluor，Cy3?minimaldye系統(tǒng)采用標(biāo)準(zhǔn)方法將基因工程藥物乙肝疫苗標(biāo)記上CY3。

(8)基因工程藥物乙肝疫苗單克隆抗體微陣列點(diǎn)樣：一張芯片點(diǎn)100個(gè)點(diǎn)，從第一個(gè)點(diǎn)至第100個(gè)點(diǎn)每一個(gè)點(diǎn)的含量以10pg/ml遞增，檢測(cè)線性范圍0.01～10ng/ml。

(9)與其它基因工程藥物進(jìn)行特異性篩選。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程藥物乙肝疫苗抗體芯片的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)將高效價(jià)、高特異性基因工程藥物乙肝疫苗1-10ml加等量的完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～22周，每只腹腔注射0.2-0.5ml，隔周免疫一次，第三次免疫后第三天抽取外周血；測(cè)定抗血清。(8)基因工程藥物乙肝疫苗單克隆抗體微陣列點(diǎn)樣：一張芯片點(diǎn)100個(gè)點(diǎn)，檢測(cè)線性范圍0.01～10ng/ml。

3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因工程藥物乙肝疫苗抗體芯片的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)進(jìn)行完畢后采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定抗血清，該方法由如下操作步驟組成：

a、包被：

以50mmol/L、pH＝9的碳酸鹽緩沖液將步驟(1)中的高純度基因工程藥物乙肝疫苗1∶500稀釋，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

b、封閉：

每孔加入pH為7.4的磷酸鹽緩沖液200μl洗滌、內(nèi)含1％山羊血清；

c、加樣：

每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl(1∶5000-10000稀釋)，每板設(shè)一正常對(duì)照、陽性對(duì)照及空白(磷酸鹽緩沖液)，洗滌；

d、加入酶標(biāo)二抗每孔100-200μl，洗滌；

e、顯色：

每孔加入底物50-100μl；

f、比色：

以空白調(diào)零，405nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度(O.D)；

g、結(jié)果判斷：P/N＝測(cè)定標(biāo)本O.D均值/陰性血清O.D均值，P/N≥2.1為陽性。

4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程藥物乙肝疫苗抗體芯片的制備方法，其特征在于所述的步驟c中的工藝條件為每孔加入1∶5000-10000稀釋后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100μl，每板設(shè)一正常對(duì)照、陽性對(duì)照及空白(磷酸鹽緩沖液)，溫度為37℃、時(shí)間為1小時(shí)，洗滌3次。