[發(fā)明專利]修飾有核苷酸的微小管的合成方法和保存方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810082627.0
• 申請(qǐng)日: 2008-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN101265287A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 檜山聰;森谷優(yōu)貴;須田達(dá)也;須藤和夫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 株式會(huì)社NTT都科摩;國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K1/107
• 分類號(hào): C07K1/107
• 代理公司: 北京三友知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 丁香蘭

技術(shù)領(lǐng)域

泛泛地說(shuō)，本發(fā)明涉及微小管的合成，特別是涉及以不依賴于生物素-抗生物素蛋白結(jié)合的方法而合成修飾了核苷酸(DNA或RNA)的微小管的方法，以及與此相伴的保存、再合成的方法。

背景技術(shù)

在真核細(xì)胞中，作為細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白絲和微小管發(fā)達(dá)，以這些為軌道，在其上通過(guò)驅(qū)動(dòng)蛋白和動(dòng)力蛋白等馬達(dá)蛋白質(zhì)來(lái)傳輸細(xì)胞內(nèi)小器官和運(yùn)輸小泡等運(yùn)輸分子。此外，驅(qū)動(dòng)蛋白和微小管的相互作用所代表的分子運(yùn)輸機(jī)制也可在生物體外再構(gòu)建，并且使微小管在固定于基板上的驅(qū)動(dòng)蛋白上進(jìn)行滑走運(yùn)動(dòng)的滑動(dòng)試驗(yàn)(gliding?assay)系統(tǒng)也廣為人們所知。

作為將這種優(yōu)異的生物功能在工程學(xué)上應(yīng)用于人工的分子運(yùn)輸系統(tǒng)的嘗試，以下實(shí)例已有報(bào)告：通過(guò)對(duì)進(jìn)行滑走運(yùn)動(dòng)的微小管表面進(jìn)行生物化學(xué)修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)功能化(例如，參見非專利文獻(xiàn)1)。在該嘗試中，已成功地將進(jìn)行滑走運(yùn)動(dòng)的微小管表面的一部分生物素化，并使其與表面修飾有鏈霉抗生物素蛋白的微珠(microbeads)等運(yùn)輸分子發(fā)生生物素-抗生物素蛋白結(jié)合，由此將運(yùn)輸分子裝載在微小管上來(lái)進(jìn)行傳輸。但是，在生物系統(tǒng)的相互作用中，生物素-抗生物素蛋白結(jié)合是具有最高親和力的結(jié)合之一，這點(diǎn)是廣為人們所知的，一旦將運(yùn)輸分子裝載到微小管上，則存在本質(zhì)上不可能卸載這樣的問(wèn)題。

相對(duì)于此，公開了以下系統(tǒng)：通過(guò)將進(jìn)行滑走運(yùn)動(dòng)的微小管表面的一部分生物素化，并使其與末端修飾有鏈霉抗生物素蛋白的單鏈DNA發(fā)生生物素-抗生物素蛋白結(jié)合，由此制作出修飾有單鏈DNA的微小管；通過(guò)微小管與具有互補(bǔ)的堿基序列的DNA的雜交來(lái)進(jìn)行裝載，并通過(guò)添加限制酶來(lái)切割DNA而進(jìn)行卸載(例如，參見專利文獻(xiàn)1和2)。

但是，存在以下問(wèn)題點(diǎn)：只能使單鏈DNA結(jié)合在得到生物素化的位點(diǎn)上，而且由于抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白是分子量較大(60kDa～67kDa)的分子，因此不能自由設(shè)定單鏈DNA對(duì)微小管的修飾比例(標(biāo)記率)。因而，若為某恒定值以上的標(biāo)記率，則也可能妨礙微小管的滑走運(yùn)動(dòng)。

非專利文獻(xiàn)1：H.Hess等，“Light-Controlled?Molecular?Shuttles?Madefrom?Motor?Proteins?Carrying?Cargo?on?Engineered?Surfaces，”Nano?Letters，Vol.1，no.5，pp.235-239，2001。

專利文獻(xiàn)1：日本特開2006-204241號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)2：日本特開2006-271323號(hào)公報(bào)

在本件專利申請(qǐng)之前，本發(fā)明人提出了以下系統(tǒng)：制作出修飾有DNA的微小管，對(duì)于該修飾有DNA的微小管而言，不僅利用了生物素-抗生物素蛋白結(jié)合，而且還著手使用了化學(xué)交聯(lián)劑，并僅利用雜交就實(shí)現(xiàn)了對(duì)運(yùn)輸分子選擇性且自律性的裝載和卸載的機(jī)制(未公開的日本特愿2005-307880)。但是，在該提案中，對(duì)于修飾有DNA的微小管的具體合成方法沒有提及。

于是，本發(fā)明的課題在于，提供以不依賴于常用的生物素-抗生物素蛋白結(jié)合的方法而合成修飾有核苷酸的微小管的方法以及與此相伴的保存、再合成的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了實(shí)現(xiàn)上述課題，在本發(fā)明中，使(a)聚合后已穩(wěn)定的微小管、(b)具有琥珀酰亞胺部分和馬來(lái)酰亞胺部分的化學(xué)交聯(lián)劑與(c)3’末端或5’末端被巰基化(チオ一ル化)的核苷酸反應(yīng)，合成出微小管-化學(xué)交聯(lián)劑-核苷酸復(fù)合體。

作為反應(yīng)的一個(gè)實(shí)例，首先，使微小管的氨基與上述化學(xué)交聯(lián)劑的琥珀酰亞胺部分反應(yīng)，合成出微小管-化學(xué)交聯(lián)劑的復(fù)合體，然后使該復(fù)合體的馬來(lái)酰亞胺部分與上述末端被巰基化的核苷酸反應(yīng)，由此合成出微小管-化學(xué)交聯(lián)劑-核苷酸的復(fù)合體(修飾有核苷酸的微小管)。

作為上述化學(xué)交聯(lián)劑，優(yōu)選使用MBS(間馬來(lái)酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯)、Sulfo-MBS(間馬來(lái)酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯磺酸鈉)、SMPB(4-(對(duì)馬來(lái)酰亞胺苯基)琥珀酰亞胺丁酸酯)、Sulfo-SMPB(4-(對(duì)馬來(lái)酰亞胺苯基)琥珀酰亞胺丁酸酯磺酸鈉)、GMBS(N-(γ-馬來(lái)酰亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯)、Sulfo-GMBS(N-(γ-馬來(lái)酰亞胺丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯磺酸鈉)、EMCS(N-(ε-馬來(lái)酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺酯)、Sulfo-EMCS(N-(ε-馬來(lái)酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺酯磺酸鈉)中的任意交聯(lián)劑。這些化學(xué)交聯(lián)劑的分子量比抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的分子量小兩個(gè)數(shù)量級(jí)，約為280Da～460Da，因此單鏈DNA對(duì)微小管的修飾比例(標(biāo)記率)的設(shè)定范圍較寬。